杉木microRNA399a的功能研究.pdf

1、microRNAs(簡稱miRNA)是一類長約20～24個堿基的內(nèi)源性單鏈RNA，它廣泛的存在于原核、病毒和真核生物中。miRNA通過對靶基因mRNA的互補配對介導靶mRNA的降解或抑制蛋白水平的翻譯，從而對靶基因的表達進行轉錄后的負調(diào)控。近些年的研究表明，miRNA對植物的生長發(fā)育和某些器官形成的各個階段都具有重要調(diào)控作用。目前研究發(fā)現(xiàn)miR399存在于擬南芥、水稻和小麥等多種植物中，是植物中一類保守的miRNA。但是，目前對Cln-

2、miR399a的生物學功能以及其自身的轉錄調(diào)控仍知之甚少。本論文運用了生物信息學、分子細胞學、高通量測序和遺傳學等方法，以模式植物擬南芥為研究材料，構建35S: Cln-miR399a前體的表達載體，獲得了Cln-miR399a過表達的擬南芥轉基因純合株系，展開了Cln-miR399a在擬南芥的表達模式和調(diào)控機制的研究。通過分子細胞生物學和轉基因株系表型的觀察得到以下結果:
　　(1)通過高通量測序和生物信息學的方法，從杉木基因組

3、DNA中鑒定并克隆了杉木Cln-miR399a的前體序列;根據(jù)Cln-miR399a高度保守的結合位點特征，在杉木基因組數(shù)據(jù)庫中預測和分析其潛在的靶基因，初步確定靶基因為Unigene56556，并且其成熟序列和擬南芥miR399c的成熟序列完全相同;
　　(2)構建過表達35S: Cln-miR399a載體，采用實時熒光定量PCR技術檢測，發(fā)現(xiàn)杉木miR399a能夠在擬南芥中異源表達;并且在開花期和果莢期，Cln-miR399a

4、在葉片的表達水平高于根部，而在根和葉中，果頰期Cln-miR399a的表達量較高，初步明確Cln-miR399a在擬南芥中存在時空表達特異性;
　　(3)實時熒光定量PCR(Real-time PCR)進一步分析顯示，Cln-miR399a能夠使靶基因PHO2的表達量顯著下調(diào);通過5'RACE實驗，明確的驗證出了Cln-miR399a對同源靶基因Unigene56556的切割位點在第21和22位之間。煙草瞬時轉化實驗結果進一步顯示