杉木的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、　　杉木為我國(guó)特產(chǎn)，分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)，是南方重要的速生用材針葉樹(shù)種之一。近幾十年，杉木病害日趨嚴(yán)重——本研究開(kāi)展杉木轉(zhuǎn)抗病基因?qū)嶒?yàn)的目的與意義即在于此?！　”緦?shí)驗(yàn)在已經(jīng)取得杉木組培快繁系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，以杉木試管苗的莖段為外植體，進(jìn)行了一系列有關(guān)杉木轉(zhuǎn)基因的研究：遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立，轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)表達(dá)研究與穩(wěn)定表達(dá)研究?！　⊥ㄟ^(guò)改變預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、蔗糖濃度、6-BA、TDZ、頭孢霉素、卡那霉素濃度，探討該因素對(duì)莖段再生不定芽的影響，

2、最終建立了以莖段為外植體的高頻再生系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，DCR+6-BA1.0mg/L+TDZ0.001mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖20g/L培養(yǎng)基對(duì)杉木莖段芽的誘導(dǎo)最有效，預(yù)培養(yǎng)2d時(shí)，芽誘導(dǎo)頻率、平均芽數(shù)和芽形成能力最高，分別為100﹪、6.35和6.35。在之后的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中皆采用該培養(yǎng)基進(jìn)行莖段的芽誘導(dǎo)。利用GUS基因的酶學(xué)特性，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，目的是在短期內(nèi)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件。通過(guò)改變預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、AS濃度、pH值、侵染

3、時(shí)間與濃度、菌體的活化方式等因素，比較其對(duì)GUS+表達(dá)率和表達(dá)量的影響，最終優(yōu)化了一系列的轉(zhuǎn)化條件：預(yù)培養(yǎng)2天、共培養(yǎng)3天、pH值5.60、侵染時(shí)間4～8min、侵染濃度OD600=0.2?！　⑿拚蟮膬?yōu)化轉(zhuǎn)化條件，應(yīng)用于穩(wěn)定表達(dá)實(shí)驗(yàn)即轉(zhuǎn)抗病基因?qū)嶒?yàn)中。根據(jù)GAFP基因具有的抑菌活性作用，將其整合入EHA105農(nóng)桿菌用于實(shí)驗(yàn)。通過(guò)采用不同的取材方式與培養(yǎng)條件進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，統(tǒng)計(jì)比較不同AS濃度下受體莖段的分化率與褐化率。光培養(yǎng)條件下

4、AS60μmol/L時(shí)莖段的分化率最高，AS20μmol/L最低；暗培養(yǎng)條件下莖段的過(guò)低的分化率，說(shuō)明這種培養(yǎng)方式不適宜用于杉木的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；總體而言，AS40μmol/L的褐化率明顯最高，AS20、80μmol/L的褐化率表現(xiàn)得較低。在嚴(yán)格的篩選步驟下，本實(shí)驗(yàn)最終僅獲得兩棵Kmr芽，其中有一棵通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)是假陽(yáng)性苗，另一棵由于生長(zhǎng)緩慢，目前無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。如此低的轉(zhuǎn)化率主要可能是杉木較為復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境造成的。如此低的轉(zhuǎn)化率，推測(cè)是由于