線粒體遺傳轉(zhuǎn)化及篩選標(biāo)記研究.pdf

1、線粒體是真核生物細(xì)胞中廣泛存在的重要細(xì)胞器之一，它不但是真核細(xì)胞進(jìn)行呼吸氧化產(chǎn)生ATP的主要場所，而且還執(zhí)行著三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化及脂肪酸的生物合成等職能。線粒體是半自主性細(xì)胞器，含有自己的基因組DNA(mtDNA)，能夠單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及合成蛋白質(zhì)。因此可以通過構(gòu)建適當(dāng)?shù)木€粒體表達(dá)載體，大量生產(chǎn)外源蛋白。與傳統(tǒng)的核基因轉(zhuǎn)化相比，細(xì)胞器轉(zhuǎn)化有著無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。這一新領(lǐng)域的相關(guān)研究不僅在理論上極大地豐富了有關(guān)線粒體的研究，并

2、且為細(xì)胞器轉(zhuǎn)化、構(gòu)建新型的生物反應(yīng)器以及線粒體相關(guān)疾病的基因治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 本文通過設(shè)計(jì)突變引物，PCR擴(kuò)增得到帶有定點(diǎn)突變的黃瓜線粒體細(xì)胞色素b基因，突變后的cob基因所編碼蛋白的第43位氨基酸由纈氨酸取代了原來的甘氨酸。由于該位點(diǎn)是抗霉素A敏感位點(diǎn)，突變后將可能導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素b對(duì)抗霉素A的敏感性降低。將突變后的cob基因作為抗霉素A抗性基因插入到線粒體表達(dá)載體pSK－E-GFP中，從而構(gòu)建帶有抗性篩選標(biāo)記的

3、黃瓜線粒體表達(dá)載體pSK－E-GFP－cobml。利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃瓜線粒體表達(dá)載體pSK－E-GFP上的cob基因5'上游調(diào)控序列進(jìn)行分析，初步預(yù)測該序列中含有假定的啟動(dòng)子區(qū)。PCR擴(kuò)增該序列片段，并將其正向插入到帶有l(wèi)acZ報(bào)告基因的啟動(dòng)子缺失質(zhì)粒pDN191acΩ上。通過測定啟動(dòng)子-lacZ報(bào)告基因融合質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α中的β-半乳糖苷酶活性，確定該啟動(dòng)子序列具有轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)這一序列進(jìn)行測定和分析，發(fā)現(xiàn)存在許多典型植物基因

4、啟動(dòng)子順式作用元件。此外，用熒光顯微鏡觀察帶有g(shù)fp基因的線粒體表達(dá)載體pSK-E-GFP在大腸桿菌DH5α中，經(jīng)一定波長的光源激發(fā)后，能夠發(fā)出綠色熒光。由此證明黃瓜線粒體表達(dá)載體上的啟動(dòng)子確實(shí)具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索，確定了黃瓜離體線粒體電轉(zhuǎn)化的條件，通過PcR擴(kuò)增外源基因gfp，證明線粒體表達(dá)載體pSK-E-GFP已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)入到離體的黃瓜線粒體中。隨后在此基礎(chǔ)上，本文初步摸索了線粒體體外轉(zhuǎn)錄條件，成功地提取了電轉(zhuǎn)化后的線粒