東方白鸛微衛(wèi)星分子標(biāo)記的位點(diǎn)篩選及保護(hù)遺傳學(xué)初步研究.pdf

1、東方白鸛是分布于亞洲的大型涉禽，IUCN紅色物種名錄的瀕危(EN)物種。近年來,由于自然棲息地面積驟減、種群數(shù)量下降、分布區(qū)片段化且日益萎縮,目前東方白鸛的全球野生種群數(shù)量僅3000只左右,且呈下降趨勢,對該物種的保護(hù)刻不容緩。目前東方白鸛的遺傳學(xué)研究進(jìn)行得較少,尚不能搞清其遺傳背景。
　　微衛(wèi)星是一種高靈敏度的分子標(biāo)記,由于在信息量、實(shí)驗(yàn)操作、分析方法等方面的明顯優(yōu)勢,微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)成為保護(hù)遺傳學(xué)研究領(lǐng)域最有力的分子標(biāo)記手段,但

2、對于東方白鸛來講,目前尚沒有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn),無法應(yīng)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記來進(jìn)行遺傳學(xué)研究,因此本研究首先利用兩種不同的方法篩選得到東方白鸛的微衛(wèi)星位點(diǎn),繼而利用篩選出的微衛(wèi)星位點(diǎn)對我國東方白鸛的遺傳多樣性進(jìn)行分析,為東方白鸛保護(hù)策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。
　　1.本研究利用交叉擴(kuò)增法篩選東方白鸛的微衛(wèi)星位點(diǎn),采用近緣種黑頭鹮鸛的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)做引物,經(jīng)過對PCR體系的優(yōu)化,在11個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)得到清晰的擴(kuò)增條帶,其余5個(gè)位點(diǎn)得不到確

3、切的擴(kuò)增產(chǎn)物。對上述6個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序分析,發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)位點(diǎn)上的擴(kuò)增產(chǎn)物含有微衛(wèi)星重復(fù)序列,而另外2個(gè)位點(diǎn)中無重復(fù)單元。
　　2.利用鏈霉親和素與生物素之間有強(qiáng)親和性的原理,首次采用FIASCO法直接篩選東方白鸛微衛(wèi)星位點(diǎn)。經(jīng)過酶切連接,探針雜交,磁珠富集,雙鏈恢復(fù),藍(lán)白斑篩選,最后得到120個(gè)陽性克隆,其中55個(gè)含有微衛(wèi)星序列重復(fù)序列。經(jīng)過分析,21條為完美型重復(fù),20條為不完全重復(fù)序列,14條為混合重復(fù)序列。此外,

4、除二堿基和三堿基序列外,我們還得到了4條六堿基,1條七堿基,2條五堿基,1條四堿基的重復(fù)序列。
　　3.在55個(gè)位點(diǎn)中選取13個(gè)適合的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,并將之與交叉擴(kuò)增法獲得的4對微衛(wèi)星引物一起進(jìn)行高效液相色譜分析,成功篩選出了能夠應(yīng)用于東方白鸛的保護(hù)遺傳學(xué)研究的10個(gè)位點(diǎn),這10個(gè)位點(diǎn)分別為C.bo133、C.bo151、C.bo102、C.bo108、C.bo109、C.bo121、C.bo168、C.bo235、Wsu13、Ws