禽戊型肝炎病毒與馬立克病毒混合感染的鑒定及禽戊肝病原學(xué)調(diào)查.pdf

1、禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是雞大肝大脾病(Big liver and spleen disease,BLS）或肝脾腫大綜合征（Hepatitis-Splenomegaly,HS）的主要病原，通常造成30~72周齡的蛋雞和肉種雞產(chǎn)蛋率下降以及死淘率升高。馬立克病毒（Marek’s Disease virus,MDV）是常見的禽腫瘤病病毒之一，引發(fā)雞的高度接觸性惡性淋巴腫瘤性的馬立克?。∕arek’s Di

2、sease），感染雞群造成雞的免疫抑制給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)雞群感染禽HEV的報(bào)道較少，還沒有發(fā)現(xiàn)蛋雞群中存在禽HEV。MDV與REV、ALV等雙重或多重混合感染的病例報(bào)道顯示出，MDV與其他病毒的共感染比單獨(dú)MDV感染造成的危害更大。截至目前沒有禽HEV與MDV共感染的報(bào)道。
　　本研究從患有大肝大脾病的海蘭褐蛋雞群采集發(fā)病雞25只和表觀健康雞5只。雞只進(jìn)行剖檢并制備病理組織切片HE染色。剖檢發(fā)現(xiàn)肝脾腫大，并有

3、腫瘤存在，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞水泡變性普遍，個別小血管周圍有數(shù)量不多的、大小不一的淋巴細(xì)胞聚集，肝竇內(nèi)出現(xiàn)零星嗜異白細(xì)胞，表現(xiàn)出典型MD癥狀并伴有炎癥反應(yīng)。
　　無菌采集30只雞的抗凝血，離心取其靠近白細(xì)胞層的血漿接種CEF，培養(yǎng)7~9d后，細(xì)胞上清用于ELISA試劑盒檢測ALV-P27抗原，細(xì)胞用于間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）。ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，所有樣品均為ALV-P27抗原陰性。IFA試驗(yàn)結(jié)果表明，用MDV的單抗H19

4、檢測到陽性細(xì)胞，而用ALV、REV的單抗JE9和11B118未檢測到陽性信號。該結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞中存在MDV野毒。
　　提取接種的CEF DNA和30只雞肝臟DNA，用特異性的5對引物PCR擴(kuò)增檢測MDV、ALV、REV。PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果顯示，MDV陽性率為46.7％（14/30），而ALV、REV全部為陰性。對部分MDV陽性樣品進(jìn)行克隆測序并分析所得序列。結(jié)果表明MDV分離株meq基因序列與經(jīng)典的MDV參考株的同源性為98.

5、7%~100%。分析堿基序列發(fā)現(xiàn)MDV分離株為強(qiáng)毒株特征，其575-577位點(diǎn)的堿基為CAC；在meq基因的多脯氨酸功能區(qū)EELCAQLCSTPPPPI重復(fù)序列中沒有脯氨酸（P）的缺失。綜合分析結(jié)果可以判定分離株來源于野毒。
　　提取送檢雞肝臟樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過套式PCR方法擴(kuò)增禽HEV ORF2部分基因序列并對陽性樣品進(jìn)行克隆測序，根據(jù)得到的禽HEV ORF2部分基因序列，比較其與國內(nèi)外參考株的同源性以及確定基因

6、型。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，發(fā)病雞肝臟樣品中禽HEV檢出率為56%（14/25），表觀健康雞禽HEV檢出率為80%（4/5）。測序結(jié)果顯示樣品禽HEV ORF2基因片段與國內(nèi)外經(jīng)典參考株的同源性為77.3%~98.3%，屬于禽HEV基因3型。
　　取禽HEV RNA陽性雞的肝臟與PBS緩沖液混合研磨并過濾，肝臟懸液作為病毒，翅靜脈注射到4只兩周齡SPF雞，對照組SPF雞注射生理鹽水。飼養(yǎng)至14天采集肝臟，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行

7、HEV RNA的鑒定，對陽性結(jié)果克隆測序以確定病毒來源。采集的肝臟樣品，套式PCR方法檢測到攻毒組有250bp大小的目的條帶，所得序列與攻毒肝臟懸液序列同源性為100%，而對照組未檢測到禽HEV RNA。該檢測結(jié)果表明，用于攻毒的臟懸液中禽HEV具有完整的生物活性可以再次傳染給雞。
　　為了解禽HEV在腫瘤病發(fā)病的種雞場中的感染率，對七個腫瘤病發(fā)病的種雞場，進(jìn)行禽HEV病原學(xué)調(diào)查。從該禽HEV陽性海蘭褐蛋雞的父母代種雞群采集糞便4

8、0份和抗凝血20份，另外從其他6個發(fā)生腫瘤病的種雞場采集糞便和雞只等樣品，共165份樣品。提取樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行禽HEV的套式PCR檢測。結(jié)果顯示，來自該海蘭褐父母代種雞群的糞便樣品中禽HEV檢出率為67.5%（27/40），血漿樣品中禽HEV檢出率為20%（4/20），而從其他6個種雞場采集的樣品中沒有檢測到禽HEV。隨機(jī)挑選兩個樣品克隆測序。序列比對結(jié)果顯示，與分離自該海蘭褐蛋雞的3個禽HEV序列同源性為98.3%~100%，

9、進(jìn)化樹分析顯示在同屬于基因3型，并在同一分支。
　　為調(diào)查市場活禽和野生鳥類禽HEV感染的狀態(tài)，給禽HEV的防控和野生鳥類疾病監(jiān)測提供數(shù)據(jù)參考。東亞-澳大利亞遷徙路線經(jīng)過我國南北兩點(diǎn)：黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)和江蘇鹽城濕地珍禽自然保護(hù)區(qū)。2014年~2016年共采集野生鳥類和活禽市場糞便樣品2691份，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后，熒光定量PCR方法檢測禽HEV RNA。結(jié)果顯示，未檢測到陽性樣品，可疑樣品7份。通過套式PCR將可疑樣品進(jìn)行驗(yàn)