四川煙草曲葉病病原分子鑒定及TYLCCNV的LAMP檢測(cè)體系的建立.pdf

1、煙草曲葉病(Tobacco leaf curl disease，TLCD)是由雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒侵染引起的一種煙草病毒病害，是熱帶及亞熱帶煙區(qū)的主要病害之一。自1973年在云南首次報(bào)道TLCD之后，在我國的其他煙區(qū)如福建、臺(tái)灣、廣西、廣東、吉林及黑龍江等地也相繼發(fā)現(xiàn)該病害，但四川煙區(qū)是否存在煙草曲葉病未見報(bào)道。目前，國內(nèi)外報(bào)道能引起TLCD的病毒近20種，國內(nèi)已報(bào)道有

2、7種雙生病毒侵染煙草引起TLCD。本實(shí)驗(yàn)室在開展四川省雙生病毒調(diào)查的過程中發(fā)現(xiàn)煙草上具有TLCD的典型癥狀，為了弄清四川煙區(qū)煙草曲葉病的發(fā)生情況以及病原種類，為該病害的防控提供理論基礎(chǔ)，對(duì)四川煙草疑似TLCD樣本進(jìn)行了病原分子鑒定，并基于鑒定結(jié)果，利用一種快速、簡單、方便的新型分子生物學(xué)技術(shù)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，構(gòu)建了四川TLCD病原之一的中國番茄黃

3、化曲葉病毒（Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的LAMP檢測(cè)體系。本文主要研究內(nèi)容如下:
　　1、四川煙草曲葉病病原分子鑒定及全基因組擴(kuò)增
　　利用雙生病毒的簡并引物PA/PB從23份四川煙草樣品中均擴(kuò)增到大約500bp的特異性片段，隨機(jī)選取4個(gè)陽性樣品進(jìn)行克隆測(cè)序，并將序列與GenBank已登錄序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，這4條序列均為TYLCCNV的特異片段。為了進(jìn)一步明確

4、樣品中是否還存在其它的雙生病毒，本研究采用四川和云南常見雙生病毒的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果從樣品中擴(kuò)增到了中國番木瓜曲葉病毒(Papayaleaf curl China virus，PaLCuCNV)的約700bp的特異性條帶。隨機(jī)分別選取一個(gè)TYLCCNV和PaLCuCNV的陽性樣品，對(duì)其DNA-A全基因組進(jìn)行克隆測(cè)序分析。結(jié)果表明，TYLCCNV-SC230的DNA-A全基因組為2738 bp，與我國TYLCCNV各分離物的核苷酸序

5、列相似性均在90％以上，與四川分離物TYLCCNV-SC226(JX679252.1)的相似性最高，為99.2％; PaLCuCNV DNA-A全基因組為2748bp，與我國PaLCuCNV各分離物的核苷酸序列相似性均在90.9％以上，與廣西的番茄分離物PaLCuCNV-G30(AJ558117)的相似性最高，為99.2％。兩者均具有典型的Begomovirus屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征。TYLCCNV和PaLCuCNV的特異性引物檢測(cè)結(jié)果

6、表明，23份樣品中TYLCCNV的侵染率為100％，PaLCuCNV的侵染率為34.8％。利用雙生病毒衛(wèi)星DNAβ的通用引物Beta01/Beta02，對(duì)23份樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，均得到約1.3kb的特異性條帶。選取樣品SC230和SC379中擴(kuò)增到的DNAβ分子進(jìn)行克隆、測(cè)序，分別獲得1337bp和1339bp的全長序列，兩者均為TYLCCNV伴隨衛(wèi)星分子，與TYLCCNB其他分離物核酸相似性比較發(fā)現(xiàn)，SC230的TYLCCNB與來

7、自四川的分離物SC65(GU199589)相似性最高，為85.3％，SC379的TYLCCNB與來自云南的分離物YN148(GU058279)相似性最高，為95.7％。
　　2、建立快速檢測(cè)TYLCCNV的LAMP檢測(cè)體系
　　通過設(shè)計(jì)引物，對(duì)LAMP體系中鎂離子(Mg2+)、dNTPs、甜菜堿等影響因子進(jìn)行優(yōu)化，建立了TYLCCNV的LAMP檢測(cè)體系。并對(duì)該LAMP體系的特異性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，煙草曲葉病常見病原如云南

8、煙草曲葉病毒(Tobacco leafcurl Yunnna virus，TbLCYNV)、勝紅薊黃脈病毒(Ageratumyellow vein virus，AYVV)、煙草曲莖病毒(Tobaco curly shoot virus，TbCSV)、中國番木瓜曲葉病毒(Papaya leaf curl China virus，PaLCuCNV)以及陰性對(duì)照均呈陰性反應(yīng)，僅受TYLCCNV侵染的樣品檢測(cè)呈陽性，說明本研究所建立的LAMP檢