1,25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞STC-1的表達(dá)作用及其凋亡的影響.pdf

1、維生素D除具備經(jīng)典的鈣磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用外，還參與到機(jī)體免疫和內(nèi)分泌代謝等多種生理功能的調(diào)節(jié)中，對(duì)奶牛鈣磷代謝紊亂也有一定的治療作用。STC-1是一種類糖蛋白激素，在哺乳動(dòng)物的多種組織中都有分布和表達(dá)，研究表明其在體內(nèi)可以通過(guò)促進(jìn)磷酸鹽的吸收和重吸收、抑制鈣的吸收來(lái)維特鈣磷穩(wěn)態(tài)的平衡。維生素D作為一種類固醇激素，參與到內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中，如抑制甲狀旁腺素(PTH)的合成與分泌和調(diào)節(jié)降鈣素(CT)的分泌，但是其對(duì)反芻動(dòng)物斯鈣素-1(STC-1

2、)的影響未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。此外，維生素D對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡也有一定作用，作為藥物使用時(shí)具有一定毒性，因此對(duì)其主要作用器官腎臟可能會(huì)產(chǎn)生損害。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的目的是研究1，25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞（MDBK細(xì)胞）STC-1表達(dá)的影響及其機(jī)制，以及1，25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞增殖凋亡的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)牛腎細(xì)胞（MDBK細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加1，25(OH)2D3處理。在探究1，25(OH)2D3對(duì)STC-1表達(dá)影

3、響中，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)在1，25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞STC-1的表達(dá)影響，并添加轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(ActD)和蛋白抑制劑放線菌酮(CHX)以探究1，25(OH)2D3是否在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯階段起到調(diào)節(jié)作用。在探究1，25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞凋亡的影響中，通過(guò)吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)對(duì)1，25(OH)2D3誘導(dǎo)凋亡的牛腎細(xì)胞進(jìn)行染色，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和凋亡情況，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率的變化，通

4、過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)凋亡基因Fas，Bax，Bcl-2表達(dá)變化，從基因水平探究1，25(OH)2D3對(duì)誘導(dǎo)牛腎細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響。結(jié)果分析如下:
　　1.1，25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞STC-1表達(dá)影響
　　在1，25(OH)2D3處理12h后，不同濃度組的STC-1基因表達(dá)量都高于對(duì)照組，且在1.0nmol/L，10nmol/L和100nmol/L上升極顯著(P＜0.01)。在100nmol/L1，25(OH)2D3

5、牛腎細(xì)胞后，不同時(shí)間組的STC-1基因表達(dá)量高于對(duì)照組，且在12h，18h和24h上升極顯著(P＜0.01)。表明添加1，25(OH)2D3處理MDBK牛腎細(xì)胞后，STC-1的表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，且這種上調(diào)呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，隨著1，25(OH)2D3濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，STC-1的表達(dá)量上升。
　　在對(duì)MDBK牛腎細(xì)胞先添加4μg/mLActD處理1h，再添加1，25(OH)2D3處理8h后，STC-1基因表達(dá)相比對(duì)照組和

6、僅添加ActD組呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)，且與單獨(dú)添加1，25(OH)2D3組無(wú)太大差異。在單獨(dú)添加1，25(OH)2D3以及聯(lián)合添加CHX和1，25(OH)2D3處理2h，4h，8h和24h后，STC-1基因表達(dá)量高于對(duì)照組，且上升極顯著(P＜0.01)。表明轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD未對(duì)1，25(OH)2D3上調(diào)STC-1表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，說(shuō)明1，25(OH)2D3通過(guò)增加mRNA的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)STC-1起到上調(diào)作用，蛋白合成抑制劑CHX對(duì)1，25(

7、OH)2D3上調(diào)STC-1表達(dá)產(chǎn)生一定抑制作用，表明翻譯水平新蛋白的合成在一定程度上影響到1，25(OH)2D3上調(diào)STC-1表達(dá)的作用。
　　2.1，25(OH)2D3對(duì)牛腎細(xì)胞凋亡的影響
　　AO/EB染色結(jié)果表明，經(jīng)100nmol/L1，25(OH)2D3處理后的MDBK細(xì)胞隨著1，25(OH)2D3作用時(shí)間的增加，凋亡情況明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，在100nmol/L1，25(OH)2D3處理后，不同時(shí)間組的細(xì)

8、胞凋亡率高于對(duì)照組，且在36h、48h、60h和72h上升極顯著(P＜0.01)。不同濃度1，25(OH)2D3處理MDBK牛腎細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，且在10nmol/L和100nmol/L上升極顯著(P＜0.01)。
　　在100nmol/L1，25(OH)2D3處理MDBK牛腎細(xì)胞后，不同時(shí)間組的Fas基因表達(dá)量高于對(duì)照組，且在60和72h上升顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01);Bax基因表達(dá)量在12h

9、至60h都上升，且在24h、36h和72h上升極顯著(P＜0.01);Bcl-2基因表達(dá)量下降，且在60和72h下降極顯著(P＜0.01)。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了1，25(OH)2D3對(duì)反芻動(dòng)物牛的腎細(xì)胞中STC-1基因表達(dá)有上調(diào)作用，并發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平使STC-1穩(wěn)定表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3誘導(dǎo)牛腎細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并在Fas、Bax和Bcl-2凋亡基因的水平上闡釋誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的機(jī)理。<