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文檔簡介
1、研究背景與目的:
哮喘是一種由多種炎性細胞參與的慢性氣道變應性炎癥性疾病,其機制尚未完全闡明。Th2細胞的過度活化分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子是哮喘發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。過去一直用“Th1/Th2失衡學說”來解釋哮喘的發(fā)病機制,但隨著對哮喘發(fā)病機制研究的深入,目前認為機體對過敏原免疫耐受的缺陷才是造成Th1/Th2失衡的根本原因,機體調(diào)節(jié)性T細胞(RegulatoryTcells,Treg細胞)數(shù)量不足和功能的缺陷
2、是哮喘患者免疫耐受缺陷的關(guān)鍵。因此,在體內(nèi)誘導并擴增Treg細胞的策略,有助于維持機體對過敏原的免疫耐受。
1,25-二羥維生素D3(1α,25-DihydroxyvitaminD3,1,25(OH)2D3是有生物活性的維生素D形式,調(diào)節(jié)骨鹽和鈣鹽/磷酸鹽代謝。除此之外,1,25(OH)2D3還具有免疫調(diào)節(jié)作用。樹突狀細胞是維生素D作用的主要靶細胞。1,25(OH)2D3對樹突狀細胞的作用主要體現(xiàn)在抑制DC的分化及成熟,下調(diào)共
3、刺激分子CD40、CD80和CD86的表達,減少IL-12分泌、促進IL-10分泌,使DC獲得耐受特性,誘導Treg細胞產(chǎn)生。這種免疫調(diào)節(jié)效應不僅僅局限于體外,動物實驗研究結(jié)果表明,1,25(OH)2D3對Th1介導的自身免疫性疾病有保護作用,但對Th2介導的哮喘的保護作用尚有爭議,多數(shù)研究顯示1,25(OH)2D3對哮喘有保護作用,但機制尚未完全闡明。
皰疹病毒侵入介質(zhì)(herpesvirusentrymediator,HV
4、EM)也稱TNFRSF14,是腫瘤壞死因子受體家族成員,廣泛地表達于T細胞、DC等細胞上。早期研究發(fā)現(xiàn)HVEM對T細胞分化有重要調(diào)節(jié)作用。HVEM既可以作為共刺激分子以HVEM-LIGHT方式促進T細胞增殖,也能作為抑制性分子以HVEM-BTLA/CD160方式抑制T細胞增殖。但HVEM在DC介導T細胞分化中的作用尚未完全清楚。研究表明,HVEM-/-的小鼠不僅不表現(xiàn)出免疫抑制,反而更容易發(fā)生自身免疫性疾病。HVEM-/-小鼠的抗原呈遞
5、細胞刺激CD4+T細胞增殖的能力較野生型小鼠增強。HVEM過表達的DC促進IL-10分泌,抑制CD4+T細胞增殖,誘導產(chǎn)IL-10的CD4+T細胞,同時HVEM過表達的DC免疫過繼治療對小鼠實驗性自身免疫性心肌炎有保護作用。這些研究初步表明,HVEM作為抑制性分子可能參與了DC介導的免疫耐受及Treg細胞產(chǎn)生。因此,我們假設(shè)1,25(OH)2D3處理的DC通過上調(diào)抑制性分子HVEM的表達,下調(diào)共刺激分子CD80、CD86和CD40表達,
6、分泌IL-10,促進Treg細胞分化、擴增,抑制效應性T細胞分化、增殖。本課題在以往工作的基礎(chǔ)上,用哮喘模型中常用的變應原OVA及致炎物質(zhì)LPS刺激1,25(OH)2D3處理的小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BMDC)觀察其對1,25-二羥維生素D3處理的樹突狀細胞表型及功能的影響。在此基礎(chǔ)上初步探討HVEM在1,25-二羥維生素D3處理的樹突狀細胞誘導Treg細胞分化中的作用。
7、
研究方法:
第二章:OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的樹突狀細胞表型及功能的影響
1.OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的樹突狀細胞表型的影響
1.1參照Inaba等人的小鼠BMDC培養(yǎng)方法,稍加改進,獲得5-6天的不成熟DC(imDC)。在不成熟DC培養(yǎng)的第3天加入10-8mol/L1,25(OH)2D3培養(yǎng)至第8天收獲,獲得1,25(OH)2D3處理的DC(D3/i
8、mDC)。不成熟DC培養(yǎng)的第7天加入1ug/ml的LPS或100ug/ml的OVA刺激24小時促進成熟,獲得成熟DC。在1,25(OH)2D3處理的DC培養(yǎng)的第7天加入1ug/ml的LPS或100ug/ml的OVA刺激24小時,獲得OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC(OVA-D3/imDC及LPS-D3/imDC)。
1.2通過與不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC、成熟DC形態(tài)的比較觀察OVA及LPS
9、刺激1,25(OH)2D3處理的DC的形態(tài)變化。
1.3OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的樹突狀細胞吞噬功能的影響
獲得OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC及成熟DC與FITC-OVA孵育后,流式細胞術(shù)檢測FITC-OVA表達強弱,判斷其吞噬功能。
1.4OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC表面共刺激分子CD80、CD
10、86、CD40及MHCⅡ表達的影響
收集OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC及成熟DC,流式細胞術(shù)檢測CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達,判斷DC成熟程度。
2.OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的樹突狀細胞功能的影響
2.1收集OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC及成
11、熟DC培養(yǎng)上清,ELISA檢測細胞因子IL-12p70、IL-6、IL-10。
2.2混合淋巴細胞反應方法檢測1,25(OH)2D3處理的DC對OVA及LPS驅(qū)動的CD4+T細胞增殖的影響
2.3OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞分化的影響
OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)96h,收集細胞,流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+F
12、oxp3+表達。
2.4FACS檢測OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC表面CCR5、CCR7及CXCR4表達的影響。
收獲OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC及成熟DC,流式細胞術(shù)檢測CCR5、CCR7及CXCR4表達。
第三章:HVEM對1,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞分化的影響
1.ELISA方法檢測
13、OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC分泌IL-2的影響。
收獲OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC及成熟DC培養(yǎng)上清,ELISA檢測細胞因子IL-2水平。
2.1,25(OH)2D3處理的DC表面抑制性分子HVEM、PDL1、PDL2表達
2.1收獲OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D
14、3處理的DC及成熟DC,流式細胞術(shù)檢測HVEM、PDL1、PDL2表達。
2.2收獲OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1,25(OH)2D3處理的DC及成熟DC,Real-timeRT-PCR方法檢測HVEMmRNA相對表達。
3.HVEM對1,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞分化的影響
3.1HVEM對OVA刺激1,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞分化
15、的影響
收獲第8天OVA刺激1,25(OH)2D3處理的DC,加入抗HVEM單克隆抗體(10ug/ml)或同型單克隆抗體(10ug/ml)阻斷48小時,與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)96h,收獲培養(yǎng)上清及細胞。ELISA檢測培養(yǎng)上清IL-10及IL-4水平,Real-timeRT-PCR檢測Foxp3mRNA及GATA-3mRNA相對表達。
3.2HVEM對LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞
16、分化的影響
收獲第8天LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC,加入抗HVEM單克隆抗體(10ug/ml)或同型單克隆抗體(10ug/ml)阻斷48小時,與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)96h,收獲培養(yǎng)上清及細胞。ELISA檢測培養(yǎng)上清IL-10及INF-γ水平,Real-timeRT-PCR方法檢測Foxp3mRNA及T-betmRNA表達。
4.HVEM對1,25(OH)2D3處理的DC抑制OVA及LPS驅(qū)動的
17、CD4+T淋巴細胞增殖的影響
收獲第8天OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC,加入抗HVEM單克隆抗體(10μg/ml)或同型單克隆抗體(10μg/ml)阻斷48小時,洗去未結(jié)合抗體,再與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)96h,觀察對CD4+T淋巴細胞增殖的影響。
研究結(jié)果:
第二章:OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC表型及功能的影響
1.OVA及LPS刺激對1,25
18、(OH)2D3處理的DC表型的影響
1.1OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC形態(tài)觀察
1,25(OH)2D3處理的DC形態(tài)同不成熟DC相似,DC表面突起少而短。OVA及LPS刺激成熟的DC具有明顯的長而多的樹枝狀突起。OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC的形態(tài)同不成熟DC類似,其表面樹枝狀突起短而偏少,有別于成熟DC明顯長而多的樹枝狀突起形態(tài)。
1.2OVA及LPS刺激對1,2
19、5(OH)2D3處理的DC吞噬功能的影響
1,25(OH)2D3處理的DC吞噬功能比不成熟DC更強(P<0.05)。OVA及LPS刺激DC成熟后其吞噬功能明顯降低。OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC仍有相對較強的吞噬功能,其吞噬強度同不成熟DC相當(P>0.05)??梢?,1,25(OH)2D3增強了DC的吞噬功能,OVA及LPS的刺激不能削弱1,25(OH)2D3處理的DC的吞噬功能。
1.3OVA及
20、LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達的影響
1,25(OH)2D3處理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達均明顯低于不成熟DC的共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達(均P<0.001)。OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC表達CD86及MHCⅡ均高于不成熟DC(P<0.05),但CD80及CD40與不成熟DC
21、相當(均P>0.05),但均低于OVA及LPS活化的成熟DC表達的CDS0、CD86、CD40及MHCⅡ(均P<0.001)。結(jié)果表明,1,25(OH)2D3顯著抑制DC成熟,1,25(OH)2D3處理的DC為不成熟DC的表型。OVA及LPS的刺激使1,25(OH)2D3處理的DC由不成熟DC的表型轉(zhuǎn)變?yōu)榘氤墒霥C的表型。
2.OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC功能的影響
2.1OVA及LPS刺激對
22、1,25(OH)2D3處理的DC分泌IL-6、IL-12p70及IL-10水平的影響
不成熟DC幾乎不分泌IL-6、IL-12p70及IL-10。1,25(OH)2D3處理的DC低分泌IL-6及IL-12p70,促進IL-10分泌。OVA及LPS刺激成熟的DC分泌大量的IL-6及IL-12p70,低分泌IL-10。與成熟的DC分泌大量IL-6及IL-12p70及IL-10相比,OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC
23、低分泌IL-6及IL-12p70(均P<0.001),但分泌大量的IL-10(均P<0.001)。這表明1,25(OH)2D3抑制DC分泌IL-6及IL-12,促進IL-10分泌。
2.21,25(OH)2D3處理的DC對OVA及LPS驅(qū)動的CD4+T細胞增殖的影響
與成熟的DC顯著刺激CD4+T細胞增殖相比,1,25(OH)2D3明顯抑制OVA及LPS驅(qū)動的CD4+T細胞增殖(P值從0.01至0.001)。
24、 2.31,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞能力
1,25(OH)2D3處理的DC抑制OVA驅(qū)動的CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3-效應性T細胞分化(39.5±5.2%vs51.2±12.0%),促進CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞分化(32.6±5.7%vs5.5±0.3%);與此類似的結(jié)果是1,25(OH)2D3處理的DC也抑制了LPS驅(qū)動的CD4+C
25、D25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3-效應性T細胞分化(32.5±5.4%vs69.4±1.7%),促進CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞分化(42.1±1.6%vs6.6±1.7%)。
2.4OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC表面CCR5、CCR7及CXCR4表達的影響
不成熟DC及1,25(OH)2D3處理的DC均高表達CCR5,但1,25(OH)2D3
26、處理的DC表達CCR5更高(46.3±2.6%vs24.9±4.1%)(P<0.01)。這表明1,25(OH)2D3處理的DC遷移至淋巴組織的能力不足。OVA及LPS刺激成熟的DC均高表達CCR7,表明成熟DC遷移至淋巴組織能力較強。與不成熟DC表達的CCR5及CCR7及CXCR4相比,OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DCCCR5表達均明顯降低,CCR7表達明顯增高,但CXCR4表達無明顯變化。結(jié)果表明,1,25(OH)2
27、D3處理的DC遷移能力較弱,OVA及LPS刺激可能使1,25(OH)2D3處理的DC獲得向淋巴組織遷移的能力。
第三章:HVEM在1,25(OH)2D3處理的DC促進Treg細胞分化中的作用
1.OVA及LPS刺激對1,25(OH)2D3處理的DC分泌IL-2水平的影響
不成熟DC及1,25(OH)2D3處理的DC幾乎不分泌IL-2。與OVA及LPS刺激的成熟DC分泌大量IL-2相比,1,25(OH)2D3
28、處理的DC經(jīng)OVA及LPS刺激后仍然低分泌IL-2(P<0.001)。表明,1,25(OH)2D3處理的DC促進初始型T細胞向Treg細胞分化不依賴DC分泌IL-2。
2.1,25(OH)2D3處理的DC表面抑制性分子HVEM、PDL1、PDL2表達的影響
2.1FACS結(jié)果表明不成熟DC及成熟DC均低表達HVEM。1,25(OH)2D3處理的DC表達HVEM明顯上調(diào),與不成熟DC相比,HVEM表達增高了21倍。1,
29、25(OH)2D3處理的DC在OVA及LPS刺激后HVEM表達仍然相對較高,與OVA及LPS刺激的成熟DC相比,HVEM表達上調(diào)分別增加4.1倍及5.8倍。PD-L1表達在OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC上調(diào)僅增加1.0倍及0.9倍。PD-L2表達在OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DC是下調(diào)的。以上結(jié)果提示1,25(OH)2D3處理的DC表達抑制性分子HVEM的上調(diào)可能與其誘導Treg細胞有關(guān)。
30、 2.2Real-timeRT-PCR檢測1,25(OH)2D3處理的DC表達HVEM明顯上調(diào),與不成熟DC相比,HVEM表達增高了17倍。OVA及LPS刺激1,25(OH)2D3處理的DCHVEM表達分別較OVA及LPS活化的成熟DC增高3.38倍及3.62倍。進一步證實了HVEM在1,25(OH)2D3處理的DC高表達。
3.HVEM對1,25(OH)2D3處理的DC誘導Treg細胞分化的影響
3.1HVEM對O
31、VA刺激1,25(OH)2D3處理的DC誘導Th2/Treg細胞分化的影響
被HVEM單克隆抗體封閉的OVA-D3/imDC與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng),促進Treg細胞分化的作用減弱,共培養(yǎng)上清中IL-10水平及Foxp3轉(zhuǎn)錄水平分別降低1.4倍及3.1倍;抑制Th2細胞分化的作用減弱,共培養(yǎng)上清中IL-4及GATA-3轉(zhuǎn)錄水平水平分別增高2.2倍及1.6倍。
3.2HVEM對LPS刺激1,25(OH)2D3處
32、理的DC誘導Th1/Treg細胞分化的影響
被HVEM單克隆抗體封閉的LPS-D3/imDC與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng),促進Treg細胞分化的作用減弱,共培養(yǎng)上清中IL-10水平及Foxp3轉(zhuǎn)錄水平分別降低1.7倍及2.1倍。抑制Th1細胞分化的作用減弱,共培養(yǎng)上清中INF-γ水平及T-betmRNA分別增高3.5倍及2.5倍。
4.HVEM對1,25(OH)2D3處理的DC抑制OVA及LPS驅(qū)動的CD4+T淋
33、巴細胞增殖的影響
被HVEM單克隆抗體封閉的OVA-D3/imDC及LPS-D3/imDC分別與CD4+T細胞共培養(yǎng),其抑制CD4+T淋巴細胞增殖能力均明顯降低(均P<0.01)。表明,1,25(OH)2D3處理的DC抑制OVA及LPS驅(qū)動的CD4+T細胞增殖部分依賴于抑制性分子HVEM的的上調(diào)。
以上結(jié)果表明,抑制性分子HVEM的上調(diào)與1,25(OH)2D3處理的DC促進Treg細胞分化、擴增,抑制效應性T細胞分化
34、、增殖有重要作用。
研究結(jié)論與意義:
1.1,25(OH)2D3處理的DC有耐受性DC的特性。1,25(OH)2D3處理的DC促進初始型T細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞分化,抑制OVA及LPS驅(qū)動的效應性CD4+T細胞增殖。
2.1,25(OH)2D3處理的DC高表達HVEM。被HVEM單克隆抗體封閉的1,25-二羥維生素D3處理的DC促進Treg細胞分化及抑制Th2/Th1細胞增殖的能力
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