HVEM在1,25(OH)2D3處理的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　哮喘是一種由多種炎性細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，其機(jī)制尚未完全闡明。Th2細(xì)胞的過(guò)度活化分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子是哮喘發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。過(guò)去一直用“Th1/Th2失衡學(xué)說(shuō)”來(lái)解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，但隨著對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制研究的深入，目前認(rèn)為機(jī)體對(duì)過(guò)敏原免疫耐受的缺陷才是造成Th1/Th2失衡的根本原因，機(jī)體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryTcells，Treg細(xì)胞)數(shù)量不足和功能的缺陷

2、是哮喘患者免疫耐受缺陷的關(guān)鍵。因此，在體內(nèi)誘導(dǎo)并擴(kuò)增Treg細(xì)胞的策略，有助于維持機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的免疫耐受。
　　1，25-二羥維生素D3(1α，25-DihydroxyvitaminD3，1，25(OH)2D3是有生物活性的維生素D形式，調(diào)節(jié)骨鹽和鈣鹽/磷酸鹽代謝。除此之外，1，25(OH)2D3還具有免疫調(diào)節(jié)作用。樹突狀細(xì)胞是維生素D作用的主要靶細(xì)胞。1，25(OH)2D3對(duì)樹突狀細(xì)胞的作用主要體現(xiàn)在抑制DC的分化及成熟，下調(diào)共

3、刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)，減少IL-12分泌、促進(jìn)IL-10分泌，使DC獲得耐受特性，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生。這種免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)不僅僅局限于體外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，1，25(OH)2D3對(duì)Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病有保護(hù)作用，但對(duì)Th2介導(dǎo)的哮喘的保護(hù)作用尚有爭(zhēng)議，多數(shù)研究顯示1，25(OH)2D3對(duì)哮喘有保護(hù)作用，但機(jī)制尚未完全闡明。
　　皰疹病毒侵入介質(zhì)（herpesvirusentrymediator,HV

4、EM）也稱TNFRSF14，是腫瘤壞死因子受體家族成員，廣泛地表達(dá)于T細(xì)胞、DC等細(xì)胞上。早期研究發(fā)現(xiàn)HVEM對(duì)T細(xì)胞分化有重要調(diào)節(jié)作用。HVEM既可以作為共刺激分子以HVEM-LIGHT方式促進(jìn)T細(xì)胞增殖，也能作為抑制性分子以HVEM-BTLA/CD160方式抑制T細(xì)胞增殖。但HVEM在DC介導(dǎo)T細(xì)胞分化中的作用尚未完全清楚。研究表明，HVEM-/-的小鼠不僅不表現(xiàn)出免疫抑制，反而更容易發(fā)生自身免疫性疾病。HVEM-/-小鼠的抗原呈遞

5、細(xì)胞刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力較野生型小鼠增強(qiáng)。HVEM過(guò)表達(dá)的DC促進(jìn)IL-10分泌，抑制CD4+T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)IL-10的CD4+T細(xì)胞，同時(shí)HVEM過(guò)表達(dá)的DC免疫過(guò)繼治療對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎有保護(hù)作用。這些研究初步表明，HVEM作為抑制性分子可能參與了DC介導(dǎo)的免疫耐受及Treg細(xì)胞產(chǎn)生。因此，我們假設(shè)1，25(OH)2D3處理的DC通過(guò)上調(diào)抑制性分子HVEM的表達(dá)，下調(diào)共刺激分子CD80、CD86和CD40表達(dá)，

6、分泌IL-10，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化、擴(kuò)增，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞分化、增殖。本課題在以往工作的基礎(chǔ)上，用哮喘模型中常用的變應(yīng)原OVA及致炎物質(zhì)LPS刺激1，25(OH)2D3處理的小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(bonemarrow-deriveddendriticcells，BMDC)觀察其對(duì)1，25-二羥維生素D3處理的樹突狀細(xì)胞表型及功能的影響。在此基礎(chǔ)上初步探討HVEM在1，25-二羥維生素D3處理的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化中的作用。

7、
　　研究方法：
　　第二章:OVA及LPS刺激對(duì)1,25(OH)2D3處理的樹突狀細(xì)胞表型及功能的影響
　　1.OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的樹突狀細(xì)胞表型的影響
　　1.1參照Inaba等人的小鼠BMDC培養(yǎng)方法，稍加改進(jìn)，獲得5-6天的不成熟DC(imDC)。在不成熟DC培養(yǎng)的第3天加入10-8mol/L1，25(OH)2D3培養(yǎng)至第8天收獲，獲得1，25(OH)2D3處理的DC(D3/i

8、mDC)。不成熟DC培養(yǎng)的第7天加入1ug/ml的LPS或100ug/ml的OVA刺激24小時(shí)促進(jìn)成熟，獲得成熟DC。在1，25(OH)2D3處理的DC培養(yǎng)的第7天加入1ug/ml的LPS或100ug/ml的OVA刺激24小時(shí)，獲得OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC(OVA-D3/imDC及LPS-D3/imDC)。
　　1.2通過(guò)與不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC、成熟DC形態(tài)的比較觀察OVA及LPS

9、刺激1，25(OH)2D3處理的DC的形態(tài)變化。
　　1.3OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的樹突狀細(xì)胞吞噬功能的影響
　　獲得OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC及成熟DC與FITC-OVA孵育后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC-OVA表達(dá)強(qiáng)弱，判斷其吞噬功能。
　　1.4OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC表面共刺激分子CD80、CD

10、86、CD40及MHCⅡ表達(dá)的影響
　　收集OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC及成熟DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達(dá)，判斷DC成熟程度。
　　2.OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的樹突狀細(xì)胞功能的影響
　　2.1收集OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC及成

11、熟DC培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12p70、IL-6、IL-10。
　　2.2混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)方法檢測(cè)1，25(OH)2D3處理的DC對(duì)OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的CD4+T細(xì)胞增殖的影響
　　2.3OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的影響
　　OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)96h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+F

12、oxp3+表達(dá)。
　　2.4FACS檢測(cè)OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC表面CCR5、CCR7及CXCR4表達(dá)的影響。
　　收獲OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC及成熟DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CCR5、CCR7及CXCR4表達(dá)。
　　第三章:HVEM對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的影響
　　1.ELISA方法檢測(cè)

13、OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC分泌IL-2的影響。
　　收獲OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC及成熟DC培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2水平。
　　2.1，25(OH)2D3處理的DC表面抑制性分子HVEM、PDL1、PDL2表達(dá)
　　2.1收獲OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D

14、3處理的DC及成熟DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HVEM、PDL1、PDL2表達(dá)。
　　2.2收獲OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC、不成熟DC、1，25(OH)2D3處理的DC及成熟DC，Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)HVEMmRNA相對(duì)表達(dá)。
　　3.HVEM對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的影響
　　3.1HVEM對(duì)OVA刺激1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化

15、的影響
　　收獲第8天OVA刺激1，25(OH)2D3處理的DC，加入抗HVEM單克隆抗體(10ug/ml)或同型單克隆抗體(10ug/ml)阻斷48小時(shí)，與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)96h，收獲培養(yǎng)上清及細(xì)胞。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IL-10及IL-4水平，Real-timeRT-PCR檢測(cè)Foxp3mRNA及GATA-3mRNA相對(duì)表達(dá)。
　　3.2HVEM對(duì)LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞

16、分化的影響
　　收獲第8天LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC，加入抗HVEM單克隆抗體(10ug/ml)或同型單克隆抗體(10ug/ml)阻斷48小時(shí)，與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)96h，收獲培養(yǎng)上清及細(xì)胞。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IL-10及INF-γ水平，Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)Foxp3mRNA及T-betmRNA表達(dá)。
　　4.HVEM對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC抑制OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的

17、CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的影響
　　收獲第8天OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC，加入抗HVEM單克隆抗體(10μg/ml)或同型單克隆抗體(10μg/ml)阻斷48小時(shí)，洗去未結(jié)合抗體，再與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)96h，觀察對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　研究結(jié)果：
　　第二章:OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC表型及功能的影響
　　1.OVA及LPS刺激對(duì)1，25

18、(OH)2D3處理的DC表型的影響
　　1.1OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC形態(tài)觀察
　　1，25(OH)2D3處理的DC形態(tài)同不成熟DC相似，DC表面突起少而短。OVA及LPS刺激成熟的DC具有明顯的長(zhǎng)而多的樹枝狀突起。OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC的形態(tài)同不成熟DC類似，其表面樹枝狀突起短而偏少，有別于成熟DC明顯長(zhǎng)而多的樹枝狀突起形態(tài)。
　　1.2OVA及LPS刺激對(duì)1，2

19、5(OH)2D3處理的DC吞噬功能的影響
　　1，25(OH)2D3處理的DC吞噬功能比不成熟DC更強(qiáng)(P＜0.05)。OVA及LPS刺激DC成熟后其吞噬功能明顯降低。OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC仍有相對(duì)較強(qiáng)的吞噬功能，其吞噬強(qiáng)度同不成熟DC相當(dāng)（P＞0.05）?？梢姡?，25(OH)2D3增強(qiáng)了DC的吞噬功能，OVA及LPS的刺激不能削弱1，25(OH)2D3處理的DC的吞噬功能。
　　1.3OVA及

20、LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達(dá)的影響
　　1，25(OH)2D3處理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達(dá)均明顯低于不成熟DC的共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表達(dá)(均P＜0.001)。OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC表達(dá)CD86及MHCⅡ均高于不成熟DC(P＜0.05)，但CD80及CD40與不成熟DC

21、相當(dāng)(均P＞0.05)，但均低于OVA及LPS活化的成熟DC表達(dá)的CDS0、CD86、CD40及MHCⅡ(均P＜0.001)。結(jié)果表明，1，25(OH)2D3顯著抑制DC成熟，1，25(OH)2D3處理的DC為不成熟DC的表型。OVA及LPS的刺激使1，25(OH)2D3處理的DC由不成熟DC的表型轉(zhuǎn)變?yōu)榘氤墒霥C的表型。
　　2.OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC功能的影響
　　2.1OVA及LPS刺激對(duì)

22、1，25(OH)2D3處理的DC分泌IL-6、IL-12p70及IL-10水平的影響
　　不成熟DC幾乎不分泌IL-6、IL-12p70及IL-10。1，25(OH)2D3處理的DC低分泌IL-6及IL-12p70，促進(jìn)IL-10分泌。OVA及LPS刺激成熟的DC分泌大量的IL-6及IL-12p70，低分泌IL-10。與成熟的DC分泌大量IL-6及IL-12p70及IL-10相比，OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC

23、低分泌IL-6及IL-12p70(均P＜0.001)，但分泌大量的IL-10(均P＜0.001)。這表明1，25(OH)2D3抑制DC分泌IL-6及IL-12，促進(jìn)IL-10分泌。
　　2.21，25(OH)2D3處理的DC對(duì)OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的CD4+T細(xì)胞增殖的影響
　　與成熟的DC顯著刺激CD4+T細(xì)胞增殖相比，1，25(OH)2D3明顯抑制OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的CD4+T細(xì)胞增殖(P值從0.01至0.001)。

24、　　2.31，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞能力
　　1，25(OH)2D3處理的DC抑制OVA驅(qū)動(dòng)的CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3-效應(yīng)性T細(xì)胞分化(39.5±5.2％vs51.2±12.0％)，促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化（32.6±5.7％vs5.5±0.3％）;與此類似的結(jié)果是1，25(OH)2D3處理的DC也抑制了LPS驅(qū)動(dòng)的CD4+C

25、D25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3-效應(yīng)性T細(xì)胞分化(32.5±5.4％vs69.4±1.7％)，促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化(42.1±1.6％vs6.6±1.7％)。
　　2.4OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC表面CCR5、CCR7及CXCR4表達(dá)的影響
　　不成熟DC及1，25(OH)2D3處理的DC均高表達(dá)CCR5，但1，25(OH)2D3

26、處理的DC表達(dá)CCR5更高（46.3±2.6％vs24.9±4.1％）(P＜0.01)。這表明1，25(OH)2D3處理的DC遷移至淋巴組織的能力不足。OVA及LPS刺激成熟的DC均高表達(dá)CCR7，表明成熟DC遷移至淋巴組織能力較強(qiáng)。與不成熟DC表達(dá)的CCR5及CCR7及CXCR4相比，OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DCCCR5表達(dá)均明顯降低，CCR7表達(dá)明顯增高，但CXCR4表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，1，25(OH)2

27、D3處理的DC遷移能力較弱，OVA及LPS刺激可能使1，25(OH)2D3處理的DC獲得向淋巴組織遷移的能力。
　　第三章:HVEM在1，25(OH)2D3處理的DC促進(jìn)Treg細(xì)胞分化中的作用
　　1.OVA及LPS刺激對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC分泌IL-2水平的影響
　　不成熟DC及1，25(OH)2D3處理的DC幾乎不分泌IL-2。與OVA及LPS刺激的成熟DC分泌大量IL-2相比，1，25(OH)2D3

28、處理的DC經(jīng)OVA及LPS刺激后仍然低分泌IL-2(P＜0.001)。表明，1，25(OH)2D3處理的DC促進(jìn)初始型T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化不依賴DC分泌IL-2。
　　2.1，25(OH)2D3處理的DC表面抑制性分子HVEM、PDL1、PDL2表達(dá)的影響
　　2.1FACS結(jié)果表明不成熟DC及成熟DC均低表達(dá)HVEM。1，25(OH)2D3處理的DC表達(dá)HVEM明顯上調(diào)，與不成熟DC相比，HVEM表達(dá)增高了21倍。1，

29、25(OH)2D3處理的DC在OVA及LPS刺激后HVEM表達(dá)仍然相對(duì)較高，與OVA及LPS刺激的成熟DC相比，HVEM表達(dá)上調(diào)分別增加4.1倍及5.8倍。PD-L1表達(dá)在OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC上調(diào)僅增加1.0倍及0.9倍。PD-L2表達(dá)在OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DC是下調(diào)的。以上結(jié)果提示1，25(OH)2D3處理的DC表達(dá)抑制性分子HVEM的上調(diào)可能與其誘導(dǎo)Treg細(xì)胞有關(guān)。
　

30、　2.2Real-timeRT-PCR檢測(cè)1，25(OH)2D3處理的DC表達(dá)HVEM明顯上調(diào)，與不成熟DC相比，HVEM表達(dá)增高了17倍。OVA及LPS刺激1，25(OH)2D3處理的DCHVEM表達(dá)分別較OVA及LPS活化的成熟DC增高3.38倍及3.62倍。進(jìn)一步證實(shí)了HVEM在1，25(OH)2D3處理的DC高表達(dá)。
　　3.HVEM對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的影響
　　3.1HVEM對(duì)O

31、VA刺激1，25(OH)2D3處理的DC誘導(dǎo)Th2/Treg細(xì)胞分化的影響
　　被HVEM單克隆抗體封閉的OVA-D3/imDC與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化的作用減弱，共培養(yǎng)上清中IL-10水平及Foxp3轉(zhuǎn)錄水平分別降低1.4倍及3.1倍;抑制Th2細(xì)胞分化的作用減弱，共培養(yǎng)上清中IL-4及GATA-3轉(zhuǎn)錄水平水平分別增高2.2倍及1.6倍。
　　3.2HVEM對(duì)LPS刺激1，25(OH)2D3處

32、理的DC誘導(dǎo)Th1/Treg細(xì)胞分化的影響
　　被HVEM單克隆抗體封閉的LPS-D3/imDC與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化的作用減弱，共培養(yǎng)上清中IL-10水平及Foxp3轉(zhuǎn)錄水平分別降低1.7倍及2.1倍。抑制Th1細(xì)胞分化的作用減弱，共培養(yǎng)上清中INF-γ水平及T-betmRNA分別增高3.5倍及2.5倍。
　　4.HVEM對(duì)1，25(OH)2D3處理的DC抑制OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的CD4+T淋

33、巴細(xì)胞增殖的影響
　　被HVEM單克隆抗體封閉的OVA-D3/imDC及LPS-D3/imDC分別與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，其抑制CD4+T淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯降低（均P＜0.01）。表明，1，25(OH)2D3處理的DC抑制OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的CD4+T細(xì)胞增殖部分依賴于抑制性分子HVEM的的上調(diào)。
　　以上結(jié)果表明，抑制性分子HVEM的上調(diào)與1，25(OH)2D3處理的DC促進(jìn)Treg細(xì)胞分化、擴(kuò)增，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞分化

34、、增殖有重要作用。
　　研究結(jié)論與意義:
　　1.1，25(OH)2D3處理的DC有耐受性DC的特性。1，25(OH)2D3處理的DC促進(jìn)初始型T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化，抑制OVA及LPS驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞增殖。
　　2.1，25(OH)2D3處理的DC高表達(dá)HVEM。被HVEM單克隆抗體封閉的1，25-二羥維生素D3處理的DC促進(jìn)Treg細(xì)胞分化及抑制Th2/Th1細(xì)胞增殖的能力