RNAi沉默HDAC2基因對1,25(OH)2D3調控肝癌HepG2細胞p21表達影響的研究.pdf

1、目的：構建組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）基因的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA），并對其在肝癌細胞株HepG2中的干擾效率進行鑒定。探討1,25(OH)2D3對HDAC2的抑制作用和抑癌基因p21WAFI/CIP1的表達情況，觀察1,25(OH)2D3是否通過抑制HDAC2的表達進而促進p21WAFI/CIP1的高表達，從而調節(jié)HepG2細胞的增殖和分化。
　　方法:1、針對HDAC2 mRNA序列設

2、計3對RNA干擾靶序列及一條陰性對照序列，定向克隆至經AgeI與EcoRI雙酶切線性化的慢病毒表達質粒pLKO.1-TRC cloning vector，構建靶向抑制HDAC2基因表達真核表達載體pLKO.1-shRNA-HDAC2，酶切驗證及測序鑒定。2、將鑒定正確的重組表達質粒pLKO.1-shRNA-HDAC2采用脂質體法共同轉染人胚腎細胞293T，包裝含HDAC2-shRNA的重組慢病毒顆粒。3、重組慢病毒顆粒感染HepG2細胞

3、，分別加入對應重組慢病毒及對照慢病毒。分別采用Realtime PCR和Western blotting檢測HDAC2基因的mRNA和蛋白表達水平，鑒定、分析重組質粒的干擾效果。運用CCK-8法檢測各組HepG2細胞增殖抑制率，觀察沉默HDAC2基因后對肝癌HepG細胞生物學特性的影響。4、培養(yǎng)肝癌HepG2細胞，經慢病毒感染和/或1,25（OH）2D3處理，通過Realtime PCR和Western blotting檢測細胞經RNA

4、干擾和/或1,25（OH）2D3處理后HDAC2及p21WAFI/CIP1基因的mRNA水平和蛋白的表達情況。
　　結果：1、shRNA退火連接克隆到慢病毒質粒pLKO.1，經酶切驗證及測序鑒定表明篩選出的重組體測序結果與預期靶序列相同，pLKO.1–shRNA重組質粒構建成功。2、獲得有效濃度穩(wěn)定表達HDAC2的shRNA的重組慢病毒顆粒。3、Realtime PCR和Western blotting檢測結果顯示與對照組相比，3

5、條干擾序列轉染肝癌HepG2細胞后均能明顯抑制HDAC2基因和蛋白表達（P<0.05）,其中以pLKO.1-HDAC2-shRNA1、3的干擾效果最明顯，兩者相比較差異無統計學意義（P>0.05），表明HDAC2基因慢病毒干擾載體已成功構建。4、CCK-8測定結果顯示，HepG2細胞中的HDAC2蛋白表達下調可導致細胞增殖抑制。5、1,25（OH）2D3處理HDAC2基因沉默后HepG細胞，與單獨沉默HDAC2基因組相比較，結果從mRN