結(jié)核分枝桿菌蛋白Rv2185c和Rv3763調(diào)控NF-kB活性的分子機制初步研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病。該病是目前世界上單一致病菌感染導(dǎo)致病死率最高的疾病之一。近年來隨著人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的廣泛流行以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)使得結(jié)核病變的復(fù)雜和難以防控。
　　NF-κB(nuclear factor-κB)是廣泛存在于各種類型細胞中的一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)

2、控許多基因的轉(zhuǎn)錄，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　MTB致病機制復(fù)雜，分泌蛋白、脂蛋白、跨膜蛋白等介導(dǎo)細菌與宿主的相互作用，與宿主接觸過程中能破壞宿主組織，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，在MTB致病過程中起重要作用，并影響宿主免疫防御。MTB能通過調(diào)節(jié)NF-κB活性來調(diào)節(jié)細胞的壞死和凋亡，然而具體的機制不是很清楚。本研究以NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為切入點，篩選調(diào)控NF-κB的MTB分泌蛋白、脂蛋白、膜蛋白，分析其調(diào)控NF-

3、κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及生物學(xué)意義，從而為進一步闡明結(jié)核分枝桿菌的致病機制和免疫機理奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.目的基因的選擇與真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
　　通過生物信息學(xué)方法以及結(jié)核的蛋白質(zhì)組學(xué)查找MTBH37Rv菌株的分泌蛋白、膜蛋白、脂蛋白，選擇了160個蛋白基因作為候選基因。其中分泌蛋白135個，膜蛋白10個，脂蛋白15個。
　　利用PCR和酶切的方法將候選基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1/V5-His

4、B中，成功構(gòu)建了各目的基因的真核表達質(zhì)粒。
　　2.調(diào)控NF-κB活性的結(jié)核分枝桿菌蛋白篩選
　　將構(gòu)建好的160個真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞，通過熒光素酶報告系統(tǒng)篩選能夠調(diào)控NF-κB活性的結(jié)核分枝桿菌蛋白，結(jié)果證實MTBRv2185c蛋白（分泌蛋白）能顯著激活NF-κB，并具有劑量依賴性和細胞特異性;而MTBRv3763蛋白（脂蛋白）顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性，呈劑量依賴性，但不具有細胞特異性。進一步構(gòu)建MTB

5、Rv2185c、Rv3763不同區(qū)域缺失的突變體并對其調(diào)控NF-κB活性的能力進行研究，結(jié)果只有全長的MTBRv2185c具有誘導(dǎo)NF-κB活性的能力，而Rv3763的前30個氨基酸對于抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性至關(guān)重要。
　　3.MTBRv2185c促進P65磷酸化
　　將構(gòu)建的表達MTBRv2185c的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染30h后通過Western-blot檢測NF-κBp65亞基磷酸化的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT