枯草芽孢桿菌N7抑菌物質(zhì)的分離、鑒定及其防控黃瓜立枯病的研究.pdf

1、目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治作物土傳病害的方法，已由過去的單一的化學(xué)防治法向化學(xué)防治與生物防治相結(jié)合的方向發(fā)展，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），作為一類在自然界中廣泛存在的重要生物資源，在防治土傳病害中有著極其重要的作用?？莶菅匡枟U菌具有發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)，可以產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)的具有廣譜抗菌作用的次生代謝產(chǎn)物，這些抗菌物質(zhì)具有抗菌譜廣，對(duì)酸堿度要求不高，熱穩(wěn)定性好，易于進(jìn)行分子加工等特點(diǎn)。這些特性都為開發(fā)新型生防制劑提供了很好的條

2、件。
　　 本文篩選出了對(duì)土傳立枯病病原菌和土傳枯萎病病原菌具有較高效拮抗作用的拮抗菌枯草芽孢桿菌N7。對(duì)枯草芽孢桿菌N7所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了深入研究，通過盆栽試驗(yàn)檢測(cè)了枯草芽孢桿菌N7及其育苗基質(zhì)對(duì)黃瓜土傳立枯病害的防治效果，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.拮抗菌株的篩選。采用稀釋平板法和平板對(duì)峙法從黃瓜根際土壤中分離出80株形態(tài)不同的菌株，其中6株對(duì)立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌具有一定拮抗效果。從中選出1株對(duì)立枯絲核菌和尖

3、孢鐮刀菌均具有拮抗作用的菌株N7用于后續(xù)試驗(yàn)。結(jié)合形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA基因序列（登錄號(hào)JQ317780）比對(duì)分析，鑒定菌株N7為枯草芽孢桿菌。
　　 2.對(duì)枯草芽孢桿菌N7的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離提取，結(jié)果表明菌株N7能分泌脂肽類的抑菌物質(zhì)，包括C13 Iturin B、C14 Iturin A、C15 Iturin A、C16 IturinA、C14Bacillomycin D和C18 Fengyein。這些物質(zhì)具有

4、良好的熱穩(wěn)定性，在40℃-80℃下抑菌活性與室溫下相比差異不顯著;且其耐受pH范圍較廣，在pH2.0-10.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的抑菌活性;對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K等不敏感;對(duì)紫外線穩(wěn)定。
　　 3.對(duì)枯草芽孢桿菌N7抗菌蛋白進(jìn)行了分離、提取和質(zhì)譜鑒定。為獲得該蛋白的基因全長(zhǎng)，對(duì)質(zhì)譜結(jié)果匹配上的蛋白酶的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增保守區(qū)域并用SEFA-PCR擴(kuò)增保守區(qū)域兩側(cè)序列。結(jié)果表明菌株N7分泌的抗菌蛋白為一種新的堿性絲氨

5、酸蛋白酶，該蛋白酶的大小為41.38 kDa，開放閱讀框全長(zhǎng)為1179bp。通過對(duì)該蛋白酶的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白酶在pH8.0-10.6之間都有較好的活性和穩(wěn)定性，最適酶活溫度為70℃，對(duì)明膠、酪蛋白和牛血清蛋白都有強(qiáng)分解能力，其中對(duì)對(duì)明膠的分解能力最強(qiáng)，1 mmol L-1的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF完全抑制抗菌蛋白酶的酶活。除此之外，5 mmol L-1的金屬離子Na+、Fe3+、Cu2+和Mg2+使酶活下降，5 mmolL-1Ca

6、2+、 K+和Mn2+能顯著提高蛋白的酶活，2％(v/v)的氧化劑H2O2和2 mmol L-1的離子螯合劑EDTA都抑制了酶的活性，2％(v/v)的還原劑Mercaptoethanol和1％(v/v)的表面活性劑Tween80對(duì)酶的活性有促進(jìn)作用。在有機(jī)試劑的試驗(yàn)中，該蛋白酶對(duì)大多數(shù)濃度為25％(v/v)的有機(jī)試劑都敏感，酶的活性被丙酮，正丁醇和乙醇所抑制，但是己烷對(duì)該酶的活性影響不大。實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白酶濃度在25μg mL-1時(shí)就能

7、很好地抑制尖孢鐮刀菌孢子和菌絲的生長(zhǎng)，經(jīng)蛋白酶液處理的尖孢鐮刀菌菌絲出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，菌絲內(nèi)的內(nèi)容物質(zhì)滲出。
　　 4.在搖瓶培養(yǎng)中采用單因子實(shí)驗(yàn)法對(duì)枯草芽孢桿菌N7的生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究，并以提高菌株N7所產(chǎn)的兩類拮抗物質(zhì)為目的，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基分別采用Plackett-Bruman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法優(yōu)化。結(jié)果表明:菌株N7的最適生長(zhǎng)條件為:初始pH值7.0、裝液量為50mL/250 mL瓶體積、30℃、170 rpm搖瓶培養(yǎng)60 h。

8、脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖7.5 g L-1、花生油1.25 g L-1、MgSO40.37 g L-1、KH2PO40.75 g L-1、谷氨酸鈉6.75 g L-1、酵母膏和NH4Cl(5∶3 w/w)10 g L-1、KCl0.16 g L-1、FeSO4·6H2O0.24mgL-1、MnSO4·H2O0.76 mg L-1。蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成:胰蛋白胨12.43 g L-1、淀粉2.5g L-1、KH2PO43.88 g L

9、-1、MgSO40.25 g L-1、NaCl5 g L-1、MnSO4·H2O20 mg L-1。
　　 5.通過盆栽試驗(yàn)研究了拮抗菌對(duì)黃瓜的促生效果和土傳立枯病的生物防控效果。結(jié)果表明:菌株N7與有機(jī)質(zhì)載體制成育苗基質(zhì)后不僅能顯著提高防病效果（與單獨(dú)施用N7菌株到土壤中相比提高31.62％），而且能顯著增加黃瓜地上部干重（與單獨(dú)施用有機(jī)質(zhì)相比提高了15.60％,與健康土壤中相比提高了32.73％）。在含有拮抗菌的育苗基質(zhì)中，