柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam22基因克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是危害養(yǎng)雞業(yè)的重大疾病，其病原有7種，包括堆型艾美耳球蟲(chóng)（Eimeriaacervulina）、布氏艾美耳球蟲(chóng)（E.brunetti）、巨型艾美耳球蟲(chóng)（E.maxima）、和緩艾美耳球蟲(chóng)（E.mitis）、毒害艾美耳球蟲(chóng)（E.necatrix）、早熟艾美耳球蟲(chóng)（E.praecox）和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella），其中E.tenella的致病性最強(qiáng)。長(zhǎng)期以來(lái)，雞球蟲(chóng)病的防治主要依賴藥物。但由于球蟲(chóng)對(duì)藥物普遍產(chǎn)生了耐藥性，引

2、起藥效下降。在雞飼養(yǎng)周期中長(zhǎng)期添加藥物導(dǎo)致藥物殘留肉蛋，直接危害人類健康。為此，雞球蟲(chóng)病的防治方法由化學(xué)預(yù)防轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防。目前，臨床上用于免疫預(yù)防雞球蟲(chóng)病的疫苗有活蟲(chóng)苗和由天然蛋白組成的亞單位疫苗兩大類。雖然雞球蟲(chóng)病活疫苗有著較強(qiáng)的免疫效果，但存在著如擴(kuò)散病原的風(fēng)險(xiǎn)、球蟲(chóng)蟲(chóng)株的抗原變異、致弱蟲(chóng)株毒力易返強(qiáng)、疫苗接種劑量難以控制、疫苗影響飼料報(bào)酬、免疫程序繁瑣、操作和免疫后的監(jiān)測(cè)和管理技術(shù)要求高等一些突出的問(wèn)題，所以亞單位疫苗尤其是基因工

3、程疫苗將成為最理想的雞球蟲(chóng)病防治策略。
　　Etgam22基因是E.tenella在配子體階段特異性表達(dá)的一種多拷貝基因，其表達(dá)產(chǎn)物與卵囊壁形成相關(guān)。盡管國(guó)外學(xué)者報(bào)道了該基因的序列，但該基因的體外表達(dá)及其重組蛋白的免疫保護(hù)力等尚未見(jiàn)有報(bào)道。為此，本研究對(duì)E.tenella配子體Etgam22基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性和雞體免疫保護(hù)力進(jìn)行了分析與評(píng)價(jià)，并對(duì)Etgam22基因在蟲(chóng)體體內(nèi)表達(dá)定位和功能進(jìn)行了探析，旨在

4、為雞球蟲(chóng)病基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　1柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam22基因的克隆與序列分析
　　從E.tenella揚(yáng)州株純化的配子體中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出Etgam22基因片段。將目的片段插入到pGEM-T-Easy載體，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白斑篩選后，對(duì)經(jīng)酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，克隆的Etgam22基因全長(zhǎng)為749 bp，具有一個(gè)大小為597 bp的完整開(kāi)放

5、閱讀框，與E.tenella VT-2株Etgam22基因序列比較，同源性為99.6％。編碼198個(gè)氨基酸。用Predicting Antigenic Peptides預(yù)測(cè)軟件分析Etgam22基因編碼區(qū)的抗原性，顯示存在4個(gè)抗原決定簇，其中脯氨酸-組氨酸富集區(qū)含有3個(gè)抗原位點(diǎn)。
　　2柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam22基因的原核表達(dá)
　　根據(jù)Etgam22基因的ORF序列和質(zhì)粒pET-28a(+)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以重組質(zhì)粒pG

6、EM-T-Easy-gam22為模板擴(kuò)增出表達(dá)片段，大小為558bp。將該基因片段與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-gam22。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，融合蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，大小約為23.8 kDa。分別以鼠抗重組蛋白EtGAM22多克隆抗體和E.tenella雞康復(fù)血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果顯示重組蛋白具有免

7、疫原性;分別以毒害艾美耳球蟲(chóng)(E.necatrix)和巨型艾美耳球蟲(chóng)（E.maxima）的康復(fù)血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，顯示重組蛋白具有一定交叉免疫原性。間接ELISA方法檢測(cè)鼠抗重組蛋白EtGAM22多抗和雞康復(fù)血清，顯示體外重組蛋白能被感染E.tenella的雞陽(yáng)性血清識(shí)別，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平。
　　3柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam22基因表達(dá)產(chǎn)物的體內(nèi)定位
　　7周齡黃羽肉雞人工感染E.tene

8、lla揚(yáng)州株后120 h、132h、144 h、156 h、168 h、180h分別撲殺取盲腸組織，制作石蠟組織切片。進(jìn)行HE染色和以鼠抗重組蛋白EtGAM22多抗為一抗的免疫熒光組織化學(xué)染色，分別用生物光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示:感染后132 h盲腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)存在大量配子體及少量近成熟的卵囊，在大配子體的成壁體和卵囊壁上有熒光標(biāo)記。結(jié)論:Etgam22基因表達(dá)產(chǎn)物主要存在于大配子體的成壁體內(nèi)，并參與卵囊壁的形成;本研究所

9、克隆的基因確實(shí)為配子體蛋白基因。
　　4柔嫩艾美耳球蟲(chóng)重組蛋白EtGAM22的免疫保護(hù)效果
　　以黃羽肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物，以平均增重、相對(duì)增重率、病變記分與卵囊減少率等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)重組蛋白的免疫保護(hù)效果進(jìn)行了初步研究，并對(duì)其誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示:重組蛋白免疫后均能誘導(dǎo)一定的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，抗體水平、CD4+水平、CD8+水平等免疫指標(biāo)均高于未免疫未攻蟲(chóng)組;與未免疫未攻蟲(chóng)組相比，重組蛋白免疫組在一