亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis幼蟲酚氧化酶原激活蛋白酶cDNA克隆和表達(dá)分析.pdf

1、為研究亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)幼蟲體內(nèi)酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidaseactivatingproteinase，PAP)表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理，本研究通過RACE技術(shù)獲得該基因的cDNA序列，對PAP基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)，通過原核表達(dá)并純化了表達(dá)產(chǎn)物，采用Westernblot和酶活測定進(jìn)行鑒定。對玉米螟幼蟲進(jìn)行細(xì)菌注射，通過RealtimePCR檢測注射前后PAP基因在不同組

2、織中mRNA水平上的表達(dá)變化情況。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)采用RT-PCR及RACE技術(shù)從亞洲玉米螟幼蟲中克隆PAP基因全長cDNA序列。該基因全長1455bp，開放閱讀框為1200bp，編碼400個氨基酸;5’和3'非編碼區(qū)分別為66bp和189bp。PAP的計算分子量約為44.8kDa，估測等電點pI為6.66。生物信息學(xué)分析表明:該基因序列中含有絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域中保守的催化三聯(lián)體，含有兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(Clip)

3、，分別為位于23-70位氨基酸的結(jié)構(gòu)域和153-394位氨基酸的結(jié)構(gòu)域，其中153-394位氨基酸也被稱為絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(serineproteinase，SP)。PAP蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，無糖基化位點，N端含有信號肽，切割位點為18與19位氨基酸之間，含有19個磷酸化位點均勻分布于整個多肽鏈中。BlastP分析結(jié)果表明:該片段的氨基酸序列與鱗翅目煙草天蛾ManducasextaPAP3precursor、ManducasextaPA

4、P3、ManducasextaPAP2、家蠶BombyxmoriPPAE、蓖麻蠶SamiacynthiariciniPAP和斜紋夜蛾SpodopteralituraPPAE3氨基酸序列具有較高的同源性，其氨基酸一致性在37％以上。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了初步分析，結(jié)果顯示:亞洲玉米螟PAP與煙草天蛾P(guān)AP3和斜紋夜蛾P(guān)PAE3的親緣關(guān)系較近，與甲殼綱的印度明對蝦FenneropenaeusindicusPPAF和斑節(jié)對蝦Pen

5、aeusmonodonPPAE親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 (2)為了對PAP蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，對PAP含有第二個Clip（153-394位氨基酸）的絲氨酸蛋白酶(SP)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了亞克隆，分別獲得了3個不同片段:PAP-SP1（144-400位氨基酸）、PAP-SP2（154-400位氨基酸）和PAP-SP3（44-400位氨基酸）。采用pET表達(dá)系統(tǒng)對PAP蛋白和SP結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行了原核表達(dá)，PAP全酶蛋白在IPTG的梯度誘導(dǎo)之后在

6、沉淀均有大量表達(dá)，重組表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的大小與預(yù)測蛋白分子量大小一致，約為46.64kDa。pET-28b-PAP-SP1在37℃溫度下，可以明顯看到0.2mmol/L和0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下有明顯的蛋白表達(dá)。pET-28b-PAP-SP2在28℃溫度誘導(dǎo)下，可以明顯觀察到0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下蛋白在上清有明顯表達(dá)。PAP-SP3通過構(gòu)建融合表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)pET-28a-HMsbT-PAP-SP3在25℃

7、溫度、0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)時有較為明顯的上清蛋白表達(dá)。通過FLAG標(biāo)簽蛋白的單克隆抗體對原核表達(dá)的PAP-SP3進(jìn)行Westernblot驗證，結(jié)果與SDS-PAGE一致，然后對大量表達(dá)的蛋白進(jìn)行Ni2+柱純化，結(jié)果在洗脫液1(Elution1)中獲得了HMsbT-PAP-SP3重組蛋白。采用測定PAP蛋白的酰胺酶活測定方法，以乙?；?異亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-精氨酸-對硝基苯胺（acetyl-Ile-Glu-Ala-Arg-

8、p-nitroanilide，IEARpNa）為底物進(jìn)行了表達(dá)產(chǎn)物酶活的初步測定。其中PAP、PAP-SP1、PAP-SP2分別以含有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株在無IPTG誘導(dǎo)和0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下，破碎細(xì)菌后對菌液上清進(jìn)行酶活測定，結(jié)果表明均有活性，分別為139.2U/mg、1853.1U/mg、1743.3U/mg，但無IPTG誘導(dǎo)下的菌液上清也有蛋白活性，分別為25.0U/mg、1573.6U/mg、568.7U/mg，誘導(dǎo)前

9、后菌液上清蛋白的比活力無顯著差異(P＞0.05)。對純化獲得的HMsbT-PAP-SP3重組蛋白PAP-SP3進(jìn)行活性測定，結(jié)果顯示其比活力為1135.1U/mg。以上結(jié)果表明:我們已成功獲得PAP蛋白及其SP結(jié)構(gòu)域的表達(dá)產(chǎn)物，且純化獲得HMsbT-PAP-SP3具有較高的比活力重組蛋白。
　　 (3)為研究細(xì)菌（大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）注射對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)PAP基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，對玉米螟幼蟲進(jìn)行生理鹽水、革蘭氏陰性菌大腸

10、桿菌及革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌注射，并通過RealtimePCR檢測注射后不同時間(0h、4h、8h、12h、24h、36h)PAP基因在不同組織（血細(xì)胞、脂肪體、中腸、體壁）中的表達(dá)變化。結(jié)果表明:亞洲玉米螟血細(xì)胞中PAP基因的表達(dá)只在大腸桿菌注射后有顯著的變化，4h時劇烈上升達(dá)到了115.3±23.2倍，隨后又急劇下降，而在其他誘導(dǎo)物誘導(dǎo)后無顯著變化(P＞0.05)。脂肪體中PAPmRNA的表達(dá)整體上變化不顯著(P＞0.05)。在中

11、腸中，枯草芽孢桿菌注射處理與對照組相比PAPmRNA的表達(dá)有明顯差異(P＞0.05)，并隨時間變化有上升的趨勢，在36h時PAPmRNA表達(dá)量最高，達(dá)到了107.6±7.2倍，其他處理組無顯著變化(P＞0.05)。在體壁中，不同的注射處理與對照組相比PAPmRNA的表達(dá)均有一定程度的升高，其中枯草芽孢桿菌處理組表達(dá)最為明顯，在12h時PAPmRNA表達(dá)量達(dá)到了對照組的105.2±1.6倍，生理鹽水處理組在8h達(dá)到了36.4±0.5倍，大