轉hrf2基因油菜抗病防衛(wèi)研究及其基于高通量測序技術的全基因組表達譜分析.pdf

1、油菜是一種重要的油料作物，但在生產過程中常常受到油菜菌核病的為害，嚴重影響其品質并降低產量。隨著植物基因工程的發(fā)展，大量的優(yōu)良抗性基因被轉入油菜中，提高其對菌核病的抗性。Harpin蛋白作為一種激發(fā)子，能夠誘導植物多種反應，如過敏反應(Hypersensitive Reaction，HR)、系統(tǒng)獲得抗病性(SAR)、促進植物生長及增強植物抗蟲性、抗旱性以及改善農作物品質。
　　 本實驗室將HarpinXooc的編碼基因hrf2，

2、通過農桿菌介導方法轉化甘藍型油菜（Brassica napus L.）揚油4號（簡稱Y4），獲得16株抗性再生T0代植株。通過T1、T2代轉基因油菜的選育工作，從T2代植株中選擇了24株PCR檢測呈陽性且具有優(yōu)艮抗病性的轉基因植株作為T3代選育材料。采用PCR檢測、RT-PCR分析以及蛋白活性驗證確定了hrf2已經整合到油菜基因組中并且能夠在轉錄水平正常表達。T3代植株PCR擴增hrf2基因呈陽性株率為86％,其中株系T3-1-19-5

3、、T3-1-21-2、T3-3-19-12、T3-3-27-9、T3-3-22-5、T3-4-22-6中所有植株檢測均為陽性植株。與受體植株相比，T3代轉基因植株24個株系中，23個株系對油菜菌核病表現(xiàn)出顯著抗病性。田間調查，T3代轉基因植株的農藝性狀表現(xiàn)穩(wěn)定:與受體植株相比，株高降低，莖基部直徑增粗，每角粒數減少，千粒重和單株產量增加。此外，DAB染色和H2O2的含量測定結果顯示，HarpinXooc在轉基因油菜中的表達能夠調控病原菌

4、侵染不同階段(0hpi、6hpi、12hpi、24 hpi)活性氧的積累。在正常生理條件下以及病原菌侵染早期(0hpi、6hpi)，與受體植株相比，轉基因油菜T-4中快速積累了大量的活性氧，并且H2O2保持了一個較高的水平;然而，在病原菌侵染后期(12h、24h)，轉基因油菜T-4反而降低了活性氧產生速度，以防止過多的ROS積累對植物細胞造成傷害。并且，在病原菌侵染前后不同階段，在HarpinXooc蛋白調控活性氧爆發(fā)的過程中，伴隨著R

5、OS產生酶編碼基因（如NAPDH、AOS）的顯著上調表達以及ROS清除酶活性的顯著提高，分別對于轉基因植株T-4中H2O2較高的積累以及過多ROS的有效清除起到了重要作用。此外，轉hrf2基因油菜的抗病性同時伴隨著大量防衛(wèi)相關基因（如NPRI、OXO、PR-1、PFD1.2）的高水平表達。因此，轉基因油菜的抗病性是HarpinXooc蛋白在植物體內介導的多種防衛(wèi)反應的結果。
　　 HarpinXooc在植物體內的表達，賦予了轉基

6、因油菜對油菜菌核病產生良好的抗病性以及優(yōu)良的農藝性狀。為了更好的解析Harpin蛋白在植物體內調控的分子作用機制，本研究中，采用基于高通量測序技術的數字基因表達譜方法，與受體植株Y4相比，分析轉基因油菜T-4的全基因組表達譜。首先，將來源于轉基因植株T-4和受體植株Y4的兩個樣品制備標簽文庫，隨后進行Illumina測序。測序質量評估結果顯示，所制備的樣品標簽庫質量很好，只含有極少雜質標簽。測序飽和度分析表明，當測序量達到3M以上時，轉

7、基因油菜T-4和受體植株Y4檢測到的基因數已經趨于飽和。因此，本研究能夠檢測出樣品中幾乎全部的表達基因，為繪制出完整的轉hrf2油菜全基因組表達譜提供保障。Clean tag拷貝數分布統(tǒng)計顯示，兩個樣品中大部分基因是低拷貝的，符合mRNA表達的不均一特征，說明兩個樣品Clean tag數據的合理性。將兩樣品的Clean tag根據指定的油菜參考基因數據庫進行比對統(tǒng)計和基因表達注釋，結果顯示，對于轉基因油菜T-4在允許最多一個堿基錯配的情

8、況下，唯一比對到一個基因的標簽分別占總標簽數和標簽種類數的39.73％和25.76％;受體植株Y4在允許最多一個堿基錯配的情況下，唯一比對到一個基因的標簽分別占總標簽數和標簽種類數的36.66％和24.83％?？梢钥闯?，由于油菜物種（Brassica napus L.）的全基因組測序結果并未公布和指定的參考基因數據庫的局限性，給表達譜數據的基因注釋帶來了限制。最終，與受體植株Y4相比，在轉基因油菜T-4葉片中得到2114個差異表達基因。

9、這些差異表達基因涉及116個生化代謝和信號轉導途徑，包括植物信號轉導(Plantsignal transduction)、苯基丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、植物與病原菌互作(Plant-pathogen interaction)、能量代謝(Energy metabolism)、次級代謝產物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、植物生理調節(jié)（Circadian

10、 rhythm-plant）、植物氧化還原代謝（Oxidative-reductive metabolism）、編程細胞死亡(Programmed celldeath)等等。我們選擇10個基因進行Real-time PCR分析，結果表明與表達譜數據的表達量變化一致，證明了表達譜數據的可靠性。此外，針對轉基因油菜T-4中2114個差異表達基因進行功能分析，主要關注涉及植物防衛(wèi)反應(Plant defense response)、植物激素（

11、Plant hormone）、活性氧產生和清除酶類（ROS production and scavengingenzymes）、植物信號和信號轉導（Plant signal and signal transduction）、轉錄因子（Transcription factor）等五大方面的相關基因。綜上，在正常生理條件下，Harpin在植物體內的表達介導了大量涉及植物生長發(fā)育、應答生物和非生物脅迫等相關基因在轉錄水平的表達模式的變化。我們