OsDMI3在ABA誘導(dǎo)的水稻葉片抗氧化防護(hù)中的作用.pdf

1、脫落酸(abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)中起著重要的信號(hào)分子作用。細(xì)胞溶質(zhì)游離Ca2+([Ca2+]i)是植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最基本的第二信使，它幾乎介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育的所有過(guò)程以及眾多的脅迫反應(yīng)。CaM是真核生物中一種研究得最清楚的Ca2+受體，大量研究顯示CaM(calmodulin)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控以及植物對(duì)各種環(huán)境刺激的反應(yīng)在脅迫反應(yīng)及激素反應(yīng)中，Ca2+/CaM和H2

2、O2之間存在交叉反饋機(jī)制。研究顯示，Ca2+/CaM參與ABA誘導(dǎo)的玉米葉片抗氧化防護(hù)過(guò)程，且作用于H2O2的上游與下游。CCaMK(calcium and calmodulinregulated kinase)有可能是下游信號(hào)分子，作為橋梁將ABA和H2O2信號(hào)繼續(xù)傳遞，誘導(dǎo)了抗氧化防護(hù)系統(tǒng)。本章首先用半定量和定量RT-PCR的方法確定了水稻中的鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶OsDMI3(Oryza Sativa does not make

3、infection3)被H2O2(10 mM)、ABA(100μM)和PEG(10％模擬自然界水分脅迫)誘導(dǎo)表達(dá)，并且活性也有被激活。用5 mM LaCl3、5mM EGTA、300μM W-5、300μM W-7、10μM KN-92和10μM KN-93鑒定出OsDMI3具有鈣-鈣調(diào)素蛋白激酶的性質(zhì)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前的研究，H2O2、ABA和PEG依次誘導(dǎo)OsDMI3基因表達(dá)，推測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方向是從PEG到ABA再到H2O2。之后的

4、抑制劑實(shí)驗(yàn)印證了我們的推測(cè):ABA合成抑制劑fluridone干擾了PEG對(duì)OsDMI3的誘導(dǎo)，H2O2清除劑DMTU和NADPH氧化酶抑制劑DPI也影響到ABA對(duì)OsDMI3的誘導(dǎo)。從ABA誘導(dǎo)H2O2積累和激活OsDMI3時(shí)間進(jìn)程上來(lái)看H2O2積累先于OsDMI3的激活，實(shí)驗(yàn)用DAB對(duì)組織中H2O2染色也顯示OsDMI3不影響H2O2的原初產(chǎn)生，但對(duì)H2O2后來(lái)的積累有明顯貢獻(xiàn)。這種交叉反饋類似于玉米中H2O2與MAPK的交叉反饋，

5、MAPK與OsDMI3的相互作用可能是這兩個(gè)交叉反饋的共同機(jī)制。
　　 我們用抑制劑實(shí)驗(yàn)，初步確定了OsDMI3可以影響ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)酶SOD與CAT。100μM ABA可以誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)酶SOD與CAT活性上升。OsDMI3的突變體NF8513與野生型相比，在ABA誘導(dǎo)下，突變體的抗氧化防護(hù)酶SOD與CAT活性峰被抑制。進(jìn)一步測(cè)定野生型和NF8513株系在15％PEG和100 mM H2O2處理下MDA含量變化和電解質(zhì)

6、泄露的變化，發(fā)現(xiàn)在兩種脅迫下突變體的指標(biāo)顯著高于野生型。為了進(jìn)一步研究這種差別，突變體和野生型被進(jìn)一步用于表型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果水分脅迫下的突變體顯示了較弱的耐受性。在做這些驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的同時(shí)我們克隆了OsDMI3基因，構(gòu)建了OsDMI3基因的干擾載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化水稻幼肧，檢測(cè)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻株系I3。轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化防護(hù)系統(tǒng)存在缺陷，并表現(xiàn)出對(duì)水分脅迫更加敏感。
　　 促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activat

7、ed Protein Kinase，MAPK)是真核細(xì)胞中普遍存在的信號(hào)組分，由逆境脅迫、細(xì)胞因子、植物激素、生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)，并在植物信號(hào)中發(fā)揮重要的作用。我們?cè)噲D闡釋OsMPK1和OsDMI3的上下游關(guān)系。首先進(jìn)行的原生質(zhì)體RNAi實(shí)驗(yàn)顯示:干擾OsDMI3可以抑制OsMPK1基因表達(dá)和OsMPK1活性的誘導(dǎo);對(duì)OsMPK1基因進(jìn)行干擾，OsDMI3基因表達(dá)和OsDMI3酶活性沒(méi)有顯著變化。另外外源處理鈣離子也可以誘導(dǎo)OsMPK1基因