玉米ZmCPK11在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中的功能分析.pdf

1、脫落酸(abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中以及植物應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫反應(yīng)中起重要作用。鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent proteinkinases，CDPKs)，是在植物中首先發(fā)現(xiàn)的一種鈣依賴型蛋白激酶，可以直接被鈣離子信號(hào)激活，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)逆境過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的證據(jù)表明，在植物碳氮代謝、離子和水分跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)以及生物

2、、非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中均有CDPKs的參與。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究參與ABA信號(hào)途徑的玉米CDPK。首先運(yùn)用生物信息學(xué)和RT-PCR技術(shù)在玉米幼苗葉片中克隆出一個(gè)鈣依賴蛋白激酶:ZmCPK11。氨基酸序列比較顯示與AtCPK4，AtCPK6，AtCPK11同源性較高，均不低于60％。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，ZmCPK11編碼產(chǎn)物為511個(gè)氨基酸，分子量為56.21kD，等電點(diǎn)為4.97。對(duì)ZmCPK11編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，

3、與典型CDPK蛋白激酶一樣，ZmCPK11也含有1個(gè)蛋白激酶結(jié)合區(qū)和4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)鈣結(jié)合區(qū)。運(yùn)用半定量實(shí)驗(yàn)證明ZmCPK11基因受ABA與H2O2誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明ZmCPK11定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。
　　 運(yùn)用半定量和定量RT-PCR的方法確定了10 mM H2O2、100μM ABA、10mMCaCl2、10％ PEG(PEG6000)均可誘導(dǎo)玉米中的ZmCPK11基因上調(diào)。ABA和H2O2處理后，玉米葉片中ZmC

4、PK11基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比，出現(xiàn)快速、瞬時(shí)的上調(diào)。Western-blot實(shí)驗(yàn)表明，10 mM H2O2、100μM ABA、10mM CaC12均誘導(dǎo)ZmCPK11蛋白水平的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的上調(diào)。免疫共沉淀激酶活性反應(yīng)表明ZmCPK11活性也被10 mM H2O2、100μM ABA、10mM CaCl2激活。并且CaC12誘導(dǎo)較早，H2O2與ABA誘導(dǎo)隨后。抑制劑實(shí)驗(yàn)表明:ABA合成抑制劑fluridone干擾了PEG對(duì)ZmCP

5、K11基因表達(dá)的誘導(dǎo)，再外源施加ABA又能誘導(dǎo)ZmCPK11基因表達(dá)上調(diào)。H2O2清除劑DMTU、CAT，NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，降低了ABA對(duì)ZmCPK11基因和ZmCPK11活性的誘導(dǎo)。與本實(shí)驗(yàn)室之前的研究:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方向是從PEG到ABA再到H2O2的結(jié)果一致。
　　 為了進(jìn)一步研究ZmCPK11的功能，構(gòu)建了ZmCPK11基因的過表達(dá)載體。運(yùn)用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZmCPK11基因可以明顯提高SO

6、D和APX酶的活性。而沉默了ZmCPK11基因，SOD和APX的活性顯著下降。經(jīng)ABA處理后，SOD和APX的活性略有上升，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZmCPK11參與了ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)，在其中發(fā)揮重要作用，對(duì)植物增強(qiáng)抗氧化防護(hù)，提高抵御非生物脅迫的能力有重要意義。
　　 本文試圖探討ZmCPK11與ZmMPK5在ABA信號(hào)通路中的關(guān)系。首先進(jìn)行的抑制劑試驗(yàn)表明:CDPK抑制劑TFP，鈣離子螯合劑EGTA處理后，ABA誘導(dǎo)的ZmMPK5

7、基因表達(dá)和ZmMPK5活性與對(duì)照相比均無明顯上調(diào);而MAPKK抑制劑PD98059，U0126處理后，ZmCPK11基因表達(dá)和ZmCPK11活性與對(duì)照相比沒有明顯變化。原生質(zhì)體基因沉默實(shí)驗(yàn)顯示:沉默ZmCPK11可以抑制ZmMPK5基因表達(dá)和ZmMPK5活性的誘導(dǎo);而沉默ZmMPK5對(duì)ABA誘導(dǎo)的ZmCPK11基因表達(dá)和ZmCPK11活性沒有顯著影響。在原生質(zhì)體中過表達(dá)ZmCPK11和ZmMPK5都可以誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)酶的活性上升，沉默Z