玉米ZmCPK11在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護中的功能分析.pdf

1、脫落酸(abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，在植物生長發(fā)育中以及植物應(yīng)對各種環(huán)境脅迫反應(yīng)中起重要作用。鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent proteinkinases，CDPKs)，是在植物中首先發(fā)現(xiàn)的一種鈣依賴型蛋白激酶，可以直接被鈣離子信號激活，在植物生長發(fā)育和適應(yīng)逆境過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的證據(jù)表明，在植物碳氮代謝、離子和水分跨膜運輸、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、氣孔運動調(diào)節(jié)、生長發(fā)育調(diào)節(jié)以及生物

2、、非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中均有CDPKs的參與。
　　 本實驗研究參與ABA信號途徑的玉米CDPK。首先運用生物信息學(xué)和RT-PCR技術(shù)在玉米幼苗葉片中克隆出一個鈣依賴蛋白激酶:ZmCPK11。氨基酸序列比較顯示與AtCPK4，AtCPK6，AtCPK11同源性較高，均不低于60％。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，ZmCPK11編碼產(chǎn)物為511個氨基酸，分子量為56.21kD，等電點為4.97。對ZmCPK11編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，

3、與典型CDPK蛋白激酶一樣，ZmCPK11也含有1個蛋白激酶結(jié)合區(qū)和4個EF手型結(jié)構(gòu)鈣結(jié)合區(qū)。運用半定量實驗證明ZmCPK11基因受ABA與H2O2誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位實驗表明ZmCPK11定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。
　　 運用半定量和定量RT-PCR的方法確定了10 mM H2O2、100μM ABA、10mMCaCl2、10％ PEG(PEG6000)均可誘導(dǎo)玉米中的ZmCPK11基因上調(diào)。ABA和H2O2處理后，玉米葉片中ZmC

4、PK11基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比，出現(xiàn)快速、瞬時的上調(diào)。Western-blot實驗表明，10 mM H2O2、100μM ABA、10mM CaC12均誘導(dǎo)ZmCPK11蛋白水平的持續(xù)時間較長的上調(diào)。免疫共沉淀激酶活性反應(yīng)表明ZmCPK11活性也被10 mM H2O2、100μM ABA、10mM CaCl2激活。并且CaC12誘導(dǎo)較早，H2O2與ABA誘導(dǎo)隨后。抑制劑實驗表明:ABA合成抑制劑fluridone干擾了PEG對ZmCP

5、K11基因表達的誘導(dǎo)，再外源施加ABA又能誘導(dǎo)ZmCPK11基因表達上調(diào)。H2O2清除劑DMTU、CAT，NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，降低了ABA對ZmCPK11基因和ZmCPK11活性的誘導(dǎo)。與本實驗室之前的研究:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方向是從PEG到ABA再到H2O2的結(jié)果一致。
　　 為了進一步研究ZmCPK11的功能，構(gòu)建了ZmCPK11基因的過表達載體。運用原生質(zhì)體瞬時表達體系，發(fā)現(xiàn)過表達ZmCPK11基因可以明顯提高SO

6、D和APX酶的活性。而沉默了ZmCPK11基因，SOD和APX的活性顯著下降。經(jīng)ABA處理后，SOD和APX的活性略有上升，實驗結(jié)果表明ZmCPK11參與了ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護，在其中發(fā)揮重要作用，對植物增強抗氧化防護，提高抵御非生物脅迫的能力有重要意義。
　　 本文試圖探討ZmCPK11與ZmMPK5在ABA信號通路中的關(guān)系。首先進行的抑制劑試驗表明:CDPK抑制劑TFP，鈣離子螯合劑EGTA處理后，ABA誘導(dǎo)的ZmMPK5

7、基因表達和ZmMPK5活性與對照相比均無明顯上調(diào);而MAPKK抑制劑PD98059，U0126處理后，ZmCPK11基因表達和ZmCPK11活性與對照相比沒有明顯變化。原生質(zhì)體基因沉默實驗顯示:沉默ZmCPK11可以抑制ZmMPK5基因表達和ZmMPK5活性的誘導(dǎo);而沉默ZmMPK5對ABA誘導(dǎo)的ZmCPK11基因表達和ZmCPK11活性沒有顯著影響。在原生質(zhì)體中過表達ZmCPK11和ZmMPK5都可以誘導(dǎo)抗氧化防護酶的活性上升，沉默Z