犬常見病毒病診斷基因芯片的研究與應用.pdf

1、本文對犬常見病毒病診斷基因芯片進行了研究。文章在獲得犬腺病毒(CAV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬細小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、狂犬病病毒RV)病原的基礎上，選取各病毒基因保守序列，進行陽性克隆篩選，提取質(zhì)粒模板，擴增純化作為探針，應用微量點樣技術將探針固定在硝酸素纖維膜上，80℃烤膜2h后，制備完成診斷基因芯片。然后提取樣品中的核酸(RNA病毒核酸首先進行反轉(zhuǎn)錄)在PCR擴增中用生物素標記，并將所獲

2、得的擴增產(chǎn)物與診斷基因芯片進行特異性的逆向點雜交，通過芯片掃描來實現(xiàn)對犬多種病原的高效檢測和分析判斷。 通過PCR或RT-PCR方法，分別擴增六種病原的保守核酸片斷，用做對基因芯片進行質(zhì)量控制，即對敏感性、特異性、重復性做了相應試驗，通過試驗確定了在42℃下最優(yōu)的雜交條件及雜交環(huán)境。將RV細胞培養(yǎng)液作10倍倍比稀釋后，進行靈敏度檢測，可檢測到的陽性雜交信號的最大稀釋度為10-11，而凝膠電泳僅能檢測到10-7，這說明芯片的靈敏度

3、是PCR的104倍。用七種混合引物，空缺單個模板，經(jīng)過生物素標記的(RT)PCR后分別與基因芯片進行雜交，試驗結果表明：在相應雜交位點和陽性位點出現(xiàn)了特異性雜交點，而陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)雜交信號，各位點重復性結果良好。通過試驗對基因芯片制備的優(yōu)化條件進行了探索，最終選擇本底好、遇溶液不變形、點不易擴散的美國Millipore公司的0.45μm混合纖維素酯膜作為基底膜，選用靈敏度、特異性好的biotin-16-dUTP標記探針方法。

4、 應用基因芯片、ELISA診斷試劑、病毒分離和PCR方法，對258份疑似病料進行了檢測效果的對比研究。研究結果表明：應用基因芯片方法對CCV和CDV檢測率比ELISA法分別高出23.4％、23.4％；對CPV和CPIV的檢測率比病毒分離培養(yǎng)方法分別高出22.8％、10.5％；對CAV和RV比PCR方法檢出率分別高出5.3％、1.7％?；蛐酒ㄍ《痉蛛x法、免疫法的符合率低，差異極顯著(p＜0.01)，與PCR法符合率在90％以