中國美利奴綿羊MHCClassⅡb區(qū)段349I12BAC克隆基因組成與結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、目的：用插有中國美利奴綿羊（新疆軍墾型）MHC ClassⅡb區(qū)genomic DNA的349I12 BAC克隆制備32P標記的放射性探針，進行噬菌體原位雜交篩選由中國美利奴綿羊（新疆軍墾型）外周免疫器官組織構(gòu)建的cDNA文庫。旨在獲得349I12 BAC克隆內(nèi)MHC片段的基因組成與結(jié)構(gòu)信息，為后續(xù)中國美利奴綿羊MHC區(qū)段基因圖譜繪制、綿羊MHC區(qū)段內(nèi)重要經(jīng)濟性狀相關(guān)基因研究和綿羊疾病抗性及易感性相關(guān)基因研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方

2、法：首先，利用GENSCAN軟件對349I12 BAC克隆內(nèi)插入MHC片段進行基因預(yù)測。其次，利用GeneQuest程序?qū)?49I12 BAC克隆內(nèi)插入片段進行電子模擬酶切電泳，篩選合適的限制性內(nèi)切酶，用于實驗中酶切349I12 BAC克隆質(zhì)粒，制備32P標記的放射性探針。然后，將篩選出來的陽性單克隆送北京華大基因測序。最后，利用SeqMan和MegAlign程序?qū)y序結(jié)果進行序列拼接和去重復(fù)，VecScreen軟件去載體，SIM4軟件

3、將其定位到349I12 BAC克隆內(nèi)的MHC片段上。
　　 結(jié)果：1、GENSCAN軟件預(yù)測結(jié)果顯示349I12 BAC克隆插入片段中含有10個基因，其中斷裂基因9個；不完整基因1個；單外顯子基因2個。該結(jié)果可為后續(xù)實驗提供一個基因數(shù)目和結(jié)構(gòu)上的參考。
　　 2、用限制性內(nèi)切酶BsaJⅠ酶切349I12 BAC克隆內(nèi)插入的中國美利奴綿羊MHC ClassⅡb區(qū)genomic DNA，然后用klenow酶對酶切片段進行末端

4、32P標記制備放射性探針。經(jīng)過多次噬菌體原位雜交篩選中國美利奴綿羊cDNA文庫后，獲得19個陽性單克隆。將篩選到的所有陽性單克隆送北京華大基因測序，測序結(jié)果經(jīng)整理后，最終得到17條不同的cDNA序列。
　　 3、利用SIM4軟件進行cDNA和genomic DNA間的序列剪接比對分析，結(jié)果顯示17條cDNA序列中有10條cDNA序列可以精確定位到349I12 BAC克隆內(nèi)的中國美利奴綿羊MHC ClassⅡb區(qū)genomic D

5、NA上。
　　 結(jié)論：本實驗通過噬菌體原位雜交篩選中國美利奴綿羊cDNA文庫，最終獲得17條不同的cDNA序列。這17條cDNA序列中有10條序列都能夠很好地定位到349I12 BAC克隆內(nèi)中國美利奴綿羊MHC ClassⅡb區(qū)genomic DNA上，說明噬菌體原位雜交篩選cDNA文庫，是一種行之有效的、高效的表達序列分離方法。
　　 本實驗可為后續(xù)中國美利奴綿羊MHC區(qū)段基因圖譜的繪制奠定基礎(chǔ)；可為后期深入研究綿羊M