枯草芽胞桿菌TR21的發(fā)酵和海洋細(xì)菌DM09的抗真菌活性物質(zhì)研究.pdf

1、本論文共包括兩部分工作:一部分是對(duì)抗香蕉枯萎病4號(hào)小種的枯草芽胞桿菌TR21進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化及田間防效的測(cè)定；另一部分是對(duì)分離自深海的廣譜抗真菌芽胞桿菌進(jìn)行了快速分子鑒定,并對(duì)其產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定。
　　 1.香蕉枯萎病是引起維管束壞死的一種毀滅性真菌病害和典型的土傳病害,嚴(yán)重影響我國(guó)香蕉生產(chǎn)。分離自石斛蘭葉片的枯草芽胞桿菌TR21對(duì)香蕉枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp.Cubense有很

2、好的拮抗效果。研究發(fā)現(xiàn)該菌的防效和芽胞數(shù)成正相關(guān),提高芽胞數(shù)可以提高經(jīng)濟(jì)效益并降低成本。本研究對(duì)TR21的產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)TR21的田間防效進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如下:
　　 首先確定篩選培養(yǎng)基:玉米粉10 g/L,豆粕粉9 g/L。然后對(duì)適合TR21產(chǎn)芽胞的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行了篩選,得到了基礎(chǔ)配方:玉米粉10 g/L,豆粕粉9 g/L,KH2PO43 g/L。初始pH7.5。然后運(yùn)用田口穩(wěn)健設(shè)計(jì)方法對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)

3、物的濃度及碳氮源搭配進(jìn)行了優(yōu)化,主要選擇五個(gè)因素:初始pH,碳源總量,氮源總量,玉米粉濃度,豆粕粉濃度,KH2PO4。經(jīng)過(guò)信噪比優(yōu)化得出了優(yōu)化條件:初始pH7.0.玉米粉8 g/L,葡萄糖12 g/L,豆粕粉16 g/L,氯化銨4 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,芽胞產(chǎn)量達(dá)到19.6×108cfu/mL,比未優(yōu)化的過(guò)程(7.0×108)提高了2.8倍。在珠海對(duì)TR21的田間防效進(jìn)行了測(cè)定:處理組發(fā)病率明顯低于對(duì)照組發(fā)病率,TR21的田間防

4、效可以達(dá)到66.95％。
　　 2.核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)]是一種世界性分布的重要植物病原真菌,在我國(guó)嚴(yán)重威脅油菜生產(chǎn)。生物防治控制核盤菌是目前菌核病防治研究的重點(diǎn)方向。我們分離到一株對(duì)核盤菌有顯著拮抗作用的來(lái)自深海的芽胞桿菌DM09,對(duì)其進(jìn)行了分類研究,對(duì)其拮抗活性物質(zhì)進(jìn)行了分離純化,結(jié)果如下:
　　 首先通過(guò)16S rDNA序列分析,分析其屬于芽胞桿菌屬,

5、但不能準(zhǔn)確鑒定到種；利用gyrB基因blast結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,最終將該菌株確定為B.velezensis。結(jié)果顯示利用16S rDNA和gyrB基因組合可以快速準(zhǔn)確的鑒定枯草芽胞桿菌組內(nèi)的近緣種。然后以核盤菌為指示菌,首先通過(guò)酸沉淀實(shí)驗(yàn)、兩步超濾實(shí)驗(yàn)推斷出活性物質(zhì)是脂肽類物質(zhì)。隨后用酸沉淀、兩步超濾、固相萃取、液相色譜的方法純化了脂肽類物質(zhì)。經(jīng)過(guò)ESI-MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,活性物質(zhì)分子量為1043.7Da和1057.7Da,兩種活性物