水稻光敏感核不育基因pms3的克隆與廣親和基因S5的功能研究.pdf

1、水稻是重要的糧食作物之一，如何更加有效地提高水稻產(chǎn)量是全世界都關(guān)注的重要問(wèn)題之一。水稻光敏感核不育(photoperiod-sensitivegeniemalesterile，PSMS)系(農(nóng)墾58S)的發(fā)現(xiàn)與利用是水稻育種的又一次突破。利用不同雜交組合，前人已對(duì)控制這種光敏感核不育的基因進(jìn)行了定位與遺傳分析，研究發(fā)現(xiàn)pms3是直接導(dǎo)致農(nóng)墾58S與農(nóng)墾58育性分離的基因。本研究主要是分離克隆了pms3基因并對(duì)其功能進(jìn)行了深入研究。pms

2、3位于第12染色體上，比較測(cè)序發(fā)現(xiàn)，pms3在農(nóng)墾58與農(nóng)墾58S中僅存在一個(gè)SNP差異。RT-PCR與RACE分析發(fā)現(xiàn)該定位區(qū)間存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，我們分別將它們命名為T(mén)ranscript-1、Transcript-2與Transcript-3。以農(nóng)墾58S為轉(zhuǎn)化受體，超量表達(dá)Transcript-1可以使農(nóng)墾58S在長(zhǎng)日照條件下花粉育性恢復(fù)。通過(guò)對(duì)Transcript-1的表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)Transcript-1的表達(dá)受光周期調(diào)控，在

3、長(zhǎng)日照條件下的表達(dá)顯著高于短日照條件;對(duì)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的幼穗進(jìn)行了更為精細(xì)的表達(dá)分析，結(jié)果顯示在長(zhǎng)日照條件下，Transcript-1在農(nóng)墾58S中的表達(dá)顯著低于農(nóng)墾58;而在短日照條件下，二者表達(dá)一致，不存在表達(dá)差異。結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化分析，我們確定Transcript-1就是我們尋找的pms3基因。我們進(jìn)一步對(duì)pms3區(qū)間的DNA甲基化程度進(jìn)行了分析，希望能找出pms3在兩個(gè)親本中表達(dá)差異的原因。結(jié)果顯示農(nóng)墾58與農(nóng)墾58S在pms3區(qū)

4、間的DNA甲基化程度確實(shí)存在差異，而且編碼區(qū)與啟動(dòng)子區(qū)域具有相反的DNA甲基化趨勢(shì):農(nóng)墾58S中啟動(dòng)子區(qū)域的CG甲基化程度明顯高于農(nóng)墾58，我們推測(cè)農(nóng)墾58S中pms3的表達(dá)下降與該基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化程度升高有密切的聯(lián)系。我們進(jìn)一步利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)pms3編碼的蛋白質(zhì)及其可能的功能，結(jié)果只預(yù)測(cè)到了一段很短的ORF。我們利用缺失轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)一步驗(yàn)證pms3是否編碼蛋白，遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)pms3是通過(guò)RNA發(fā)揮作用，編碼一個(gè)

5、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA);同時(shí)們還發(fā)現(xiàn)pms3中包含SNP的52bp序列是必不可少的。RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該區(qū)間存在類似莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能形成smallRNA，通過(guò)對(duì)水稻smallRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，我們也在該區(qū)間確實(shí)找到了幾個(gè)smallRNA。我們用stem-loopRTPCR的方法驗(yàn)證了它們的存在。綜合上述結(jié)果，我們推測(cè)該區(qū)間形成的smallRNA與DNA甲基化存在一定的聯(lián)系，從而調(diào)節(jié)pms3的表達(dá)

6、。我們還對(duì)定位區(qū)間其它基因進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化與表達(dá)分析:位于pms3上游的基因AK111270超量表達(dá)之后，使農(nóng)墾58S短日照育性恢復(fù)推遲。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在AK111270超表達(dá)植株中，pms3的表達(dá)下降，DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)pms3啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化程度明顯上升。對(duì)該區(qū)間的smallRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AK111270超表達(dá)植株中smallRNA的表達(dá)上升。我們推測(cè)AK111270的超量表達(dá)，使其內(nèi)源的同源序列（即pms3的啟動(dòng)子區(qū)域

7、）發(fā)生了RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)，使pms3的表達(dá)下降，從而使農(nóng)墾58S短日照育性推遲恢復(fù)。位于pms3反鏈上的基因Transcript-3超量表達(dá)后，對(duì)花粉的育性沒(méi)有影響，但是它在小穗中特異表達(dá)，這種特異的表達(dá)模式暗示Transcript-3肯定有特異的功能?？傊?，定位區(qū)間內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本之間在結(jié)構(gòu)上的緊密聯(lián)系暗示它們的功能也可能相互聯(lián)系，相互影響。
　　水稻秈、粳亞種間的雜種優(yōu)勢(shì)的利用是提高水稻產(chǎn)量的又一重要途徑。但是秈

8、、粳雜種F1普遍存在的不育或者半不育現(xiàn)象使得秈、粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用受到極大的限制。在水稻中存在一類特殊的種質(zhì)資源稱為廣親和品種，它們分別與秈稻和粳稻雜交，其后代均表現(xiàn)正?？捎?。鼬基因是控制秈粳廣親和性狀的一個(gè)主效基因。本研究的目的就是分離克隆水稻廣親和基因舾，并對(duì)該基因功能、作用機(jī)理進(jìn)行深入的研究。筋編碼一個(gè)天冬氨酸蛋白酶，比較測(cè)序發(fā)現(xiàn)，粳稻與秈稻S5編碼區(qū)存在兩個(gè)氨基酸的差別，分別由粳稻中的亮氨酸(Leu)與纈氨酸(Val)替換為