應(yīng)用基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)大豆脂肪酸代謝進(jìn)而選育高油和高油酸大豆新材料.pdf

1、學(xué)校代碼：—102—00分類號：094研究生學(xué)號：—1020020—0710226密級：玉東牡JIf予冠大雪博士學(xué)位論文應(yīng)用基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)大豆脂肪酸代謝進(jìn)而選育高油和高油酸大豆新材料Regulationoffattyacidmetabolisminseedsofsoybeanwithgenesilencingtogethighoilandhigholeicacidmaterials作者：陳偉指導(dǎo)教師：劉立俠學(xué)科專業(yè)：植物學(xué)研究方向：植

2、物生物工程東北師范人。Z學(xué)位評定委員會2011q6JJ摘要應(yīng)用基因工程技術(shù)調(diào)節(jié)大豆脂類代謝途徑，探索相關(guān)基因的調(diào)控機制，對于大豆脂肪酸合成的基礎(chǔ)研究和品質(zhì)育種是一項有效和快捷的途徑。本論文以吉林大豆為材料，以蛋白質(zhì)和脂肪酸代謝的“底物競爭”假說為依據(jù)，采用基因工程技術(shù)，探討大豆向刃(脂肪酸脫氫酶)基因和p印c(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)基因在調(diào)控大豆種子脂肪酸合成代謝中的作用，進(jìn)而選育高油酸和高油的轉(zhuǎn)基因大豆材料。根據(jù)基因沉默原理，克隆了

3、大豆向d2和p唧基因的片段，分別構(gòu)建了基因沉默ihpIⅢA高效表達(dá)載體pBIGFPFAD2、pBIFAD2和pBIPEP；以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法并結(jié)合嫁接技術(shù)轉(zhuǎn)化和篩選大豆吉林35，對再生植株進(jìn)行分子鑒定，基因功能檢測和一系列生理生化實驗，分析和研究了p印c基因和叩c基因在大豆種子發(fā)育過程中的時間表達(dá)模式。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將pBIGFPFAD2載體轉(zhuǎn)化三個高油大豆品種吉林35，吉林47和吉科豆l號。檢測報告基因GFP的表

4、達(dá)，結(jié)果表明，吉林35是大豆胚尖再生系統(tǒng)中最敏感的品種，其表達(dá)效率可達(dá)到429％。本實驗優(yōu)化了大豆胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的卡那霉素篩選壓力，并首次嘗試將嫁接技術(shù)應(yīng)用到大豆再生系統(tǒng)中替代生根煉苗過程，再生苗的成活率從10％提高到80％，煉苗周期由45天縮短到10天。pBIFAD2轉(zhuǎn)化吉林35共獲得180株再生植株，其中34株P(guān)CR陽性植株經(jīng)分子檢測證明外源基因已經(jīng)整合到植物基因組中，8份材料種子油酸含量有不同程度的提高。陽性材料通過Southem和

5、Nonhem雜交檢測、脂肪酸含量及油酸脫氫比例(ODP)分析，證明ihpRNA沉默廊比基因，導(dǎo)致了油酸含量增加、亞油酸含量降低的效果，并且具有孟德爾單因素遺傳規(guī)律。陽性植株種子脂肪酸檢測表明，油酸含量從對照的175％提高到50％左右。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化pBIPEP載體到吉林35大豆中，共獲得再生植株265株，PCR陽性植株64株，Southem雜交證明目的基因整合至基因組中。75％陽性植株(48株)的油含量有不同程度的提高，其中9份陽性