基于piggyBac轉座子的家蠶定向遺傳轉化研究.pdf

1、遺傳轉化技術已在生物基因功能分析、生理生化過程研究以及生物反應器開發(fā)等方面大量應用,但同時還存在許多問題,包括外源基因向基因組的整合效率較低,轉基因有時不能按預定的方式表達,轉入基因后有可能引起生物本身的功能基因發(fā)生突變等。要解決這些問題,提高遺傳轉化的效率,并提高整合的定向性(Site-specific integration)是關鍵。
　　 家蠶Bombyx mori L.是重要的經(jīng)濟昆蟲,同時也是昆蟲基因功能和生命過程研究

2、的模式昆蟲。近十多年來,人們對其開展了大量的遺傳轉化研究,獲得了很多的家蠶轉基因品系,但對其定向遺傳轉化的報道還很少。為此,本實驗在家蠶細胞中進行了定向遺傳轉化的初步研究,以期為提高家蠶遺傳轉化效率、提高遺傳轉化的定向性提供一些借鑒。主要結果如下:
　　 1.采用雙熒光素酶報告基因檢測(Dual-Luciferase Reporter Assay)技術,比較了熱激蛋白啟動子(hsp70和hsp82)、家蠶肌動蛋白啟動子(.A3)

3、、多聚泛素(polyubiquitin)啟動子(PuB)、α微管蛋白啟動子(α-tub)、絲素輕鏈啟動子(Fib-L)、人工合成啟動子3xP3及苜蓿丫紋夜蛾多角體病毒(AcNPV)增強子-啟動子組合(hr5-IE1)8種啟動子在家蠶細胞BmN內(nèi)的活性。結果顯示hr5-IE1活性最強,A3次之,其余啟動子活性均較弱。構建含有hr5-IE1啟動子和piggyBac的轉座酶編碼區(qū)的質粒作為輔助質粒,與EGFP載體質粒一起轉染家蠶細胞后,實現(xiàn)了

4、EGFP基因整合到細胞基因組中。
　　 2.采用質粒間轉座分析(Interplasmid transposition assay)方法,研究了酵母轉錄激活蛋白Gal4的DNA結合區(qū)(DNA-binding domain,DBD)序列和UAS組成的系統(tǒng)(簡稱Gal4-JAS系統(tǒng))在提高家蠶遺傳轉化定向性中的作用。將三個質粒,即表達Gal4-piggyBac融合轉座酶的輔助質粒,含有Kan抗性基因和E.coli ori因子的供體質粒

5、,及含有UAS定向序列的受體質粒,共轉染家蠶卵巢細胞系(Bm2-12)和果蠅細胞系(S2),結果發(fā)現(xiàn),在Gal4-piggyBac融合體作用下,兩種細胞中的轉座效率分別比對照提高了3.8倍和4.5倍,而且插入位置趨向于少數(shù)幾個位點。3.LexA是生物體內(nèi)一種重要的阻遏蛋白,其結合的DNA位點(Binding sites,BS)具明顯的序列特征。我們依據(jù)LexA與其BS序列結合的原理,構建了可表達LexA-piggyBac融合轉座酶的輔助

6、質粒,以及含LexA BS序列的受體質粒pGDV1-Lex-BS。將這兩個質粒和供體質粒pB[Koα]一起轉染家蠶Bm-12細胞,結果發(fā)現(xiàn),與對照相比轉化效率提高了9.0倍,但轉座并不集中在一些特定的位點。與前述Gal4-piggyBac融合轉座酶相比,在Bm-12細胞系中,LexA-piggyBac介導的遺傳轉化效率要高一些,但對轉化的定向能力較差。
　　 4.在家蠶細胞內(nèi)建立了一個基因組中插入EGFP-Lex-BS片段的細胞

7、系。用于今后LexA-piggyBac融合轉座酶在提高轉座效率、定向能力等方面的進一步研究。
　　 根據(jù)本研究結果,針對目前家蠶遺傳轉化效率較低、轉基因的整合缺乏定向性的不足,可選擇采用hr5-IE1作為piggy,Bac轉座酶表達的啟動子,以提高該酶的表達水平,從而提高轉化效率;也可采用piggyBac和Gal4-DBD或LexA融合后所形成的轉座酶來提高轉化效率;另外,Gal4-piggyBac融合酶還可考慮用于定向遺傳轉化