2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本研究采用RT-PCR技術擴增A/Swine/Anhui/01/06(H3N8)亞型豬流感病毒神經(jīng)氨酸酶NA基因,然后將該基因克隆到pET-28a(+)原核表達載體中,構(gòu)建原核表達載體pET-NA;經(jīng)用PCR、雙酶切和DNA核苷酸序列測定等方法鑒定,得到陽性重組質(zhì)粒;再將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21感受態(tài)細胞中,用卡那霉素抗性篩選得到穩(wěn)定表達的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21;在37℃,1mmol/LIPTG誘導3h條件下宿主菌B

2、L21成功表達重組蛋白;表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,重組蛋白主要以包涵體的形式存在,改變IPTG濃度和降低誘導溫度,無法使目的蛋白可溶性表達;將轉(zhuǎn)化后宿主菌BL21在不同IPTG濃度和不同培養(yǎng)時間下進行誘導,得到表達NA基因的最佳誘導濃度為1mmol/L和最佳誘導時間為6h;表達蛋白經(jīng)尿素變性與復性,得到純化的可溶性重組蛋白。用Westernblot分析表明,表達產(chǎn)物能與H3N8亞型豬流感病毒(SIV)感染豬陽性血清發(fā)生特異性反應,

3、具有良好的免疫學活性。
   以純化后的重組蛋白作為包被抗原建立了檢測H3N8亞型SIV抗體的間接ELISA方法。通過反應條件的優(yōu)化,得出間接ELISA最佳工作條件:抗原包被濃度為8.68×10-4↗↗μ↖↖g/ml;血清稀釋度為1:80;封閉液為5%脫脂乳;封閉時間為1.5h;一抗作用時間為0.5h;酶標抗體稀釋倍數(shù)為1:1000;酶標抗體作用時間為0.5h。陰陽性血清的判斷標準分別確定為OD630nm≤0.307和OD630

4、nm≥0.353。通過特異性試驗結(jié)果顯示,該方法與H1、H5亞型SIV以及豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等相關豬病陽性血清無交叉反應。通過重復性試驗表明,用同一批制備的重組蛋白包被ELISA板的批內(nèi)變異系數(shù)在3.60%~7.50%之間;用同一批制備的重組蛋白包被ELISA板的批間變異系在3.38%~7.89%之間。分別用已建立的間接ELISA方法和血凝抑制試驗(HI)對臨床豬血清檢測結(jié)果進行對比。結(jié)果顯示,間接ELISA方法與血凝抑制

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