玉米脫水素基因ZmDHN2b和Rab17的分離與功能分析.pdf

1、干旱、低溫和鹽漬等非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要因素，植物在受到這些脅迫信號刺激后，會產(chǎn)生一系列響應蛋白來保護細胞代謝，而脫水素（dehydrins）屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant proteins，LEA）的第2家族成員。它具有高度無序結(jié)構(gòu)，可在植物種子發(fā)育晚期或植物受到干旱、低溫和鹽漬或ABA處理時大量表達。脫水素具有廣泛的生物學功能，如防止細胞脫水；結(jié)合到含有酸性磷脂的膜脂囊泡

2、上以穩(wěn)定細胞膜；結(jié)合金屬離子；清除羥基自由基；防止脂膜過氧化和保護冷敏感性酶活性；直接參與植物的冷適應過程或作為分子伴侶等。
　　 本研究從玉米葉片中分離到2個脫水素基因ZmDHN2b和Rab17，并通過over-lap PCR的方法獲得了Rab17突變及缺失片段。利用Northern blot和Western blot方法，研究了在各種非生物脅迫條件下ZmDHN2b轉(zhuǎn)錄體與蛋白的表達情況。并對獲得的T2代轉(zhuǎn)基因煙草純合體，在逆

3、境脅迫條件下進行種子萌發(fā)、根系伸長以及各種生理指標的測定。主要結(jié)果如下：
　　 1.通過RT-PCR的方法從玉米葉片中分離到2個脫水素基因ZmDHN2b（GenBank注冊號：FJ436407）和Rab17（GenBank注冊號：DQ851590）。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)這2種蛋白具有高親水性。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，ZmDHN2b編碼的蛋白序列與水稻、大麥、擬南芥中的SK3型脫水素序列同源性最高；Rab17與大麥中的多個Y2SK2型脫水素

4、具有較高的同源性。
　　 2.對玉米幼苗進行干旱、高鹽、低溫、H2O2及ABA處理，提取葉片總RNA進行Northern雜交，結(jié)果表明，正常生長狀態(tài)下ZmDHN2b僅有極少量表達；以上各種脅迫均能誘導ZmDHN2b基因的表達。其中低溫和高鹽對玉米ZmDHN2b基因的表達影響最為明顯，能迅速誘導ZmDHN2b表達且在48h內(nèi)有2個表達高峰；在48h內(nèi)ZmDHN2b基因的表達受ABA、干旱、H2O2誘導持續(xù)升高，H2O2誘導效果最弱

5、。低溫處理條件下，ZmDHN2b主要在莖和葉中表達，根中表達量較低。
　　 3.構(gòu)建了原核表達載體pET-ZmDHN2b，并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白，誘導純化后免疫小白鼠，制備抗體。過表達ZmDHN2b并沒有提高大腸桿菌對各種脅迫的抗性。Western雜交分析表明，ZmDHN2b蛋白在玉米幼苗葉片中受低溫誘導，且檢測到2條特異條帶，可能存在翻譯后修飾作用。
　　 4.構(gòu)建了表達載體pROKⅡ-ZmDHN2b，轉(zhuǎn)化

6、煙草（NC89）。分別在基因組、mRNA和蛋白質(zhì)水平上鑒定了6個株系的轉(zhuǎn)基因煙草。以表達量高的T2-6、表達量中等的T2-7、表達量低的T2-14株系作為后續(xù)研究對象。
　　 5.低溫條件下，過表達ZmDHN2b基因的轉(zhuǎn)基因煙草種子比野生型煙草種子萌發(fā)率高；干旱和高鹽脅迫條件下，過表達ZmDHN2b基因的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗與野生型煙草幼苗長勢基本一致；低溫條件下，過表達ZmDHN2b基因的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗比野生型煙草有更好的長勢（主根

7、長、葉片數(shù)多等）。
　　 6.低溫條件下，轉(zhuǎn)ZmDHN2b基因煙草的丙二醛含量，電解質(zhì)外滲以及產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2-）比野生型煙草低，可溶性糖和脯氨酸含量比野生型煙草高，說明過表達ZmDHN2b基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草對低溫脅迫的抗性。
　　 7.將pBI121-ZmDHN2b-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞中瞬時表達。結(jié)果表明，ZmDHN2b-GFP蛋白定位于整個細胞中，在細胞膜邊界以及細胞質(zhì)和細胞核中均有表達。

8、r>　　 8.利用over-lap PCR方法定點突變Rab17基因片段，使之翻譯蛋白中的磷酸激酶結(jié)合位點突變（mRab17）或Y片段缺失（dRab17），測序結(jié)果表明，已經(jīng)獲得了3種不同基因型片段。將3種基因片段分別轉(zhuǎn)入煙草中，PCR和Western blot結(jié)果表明3種片段已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入煙草，且在蛋白水平能正確翻譯各自蛋白。
　　 9.正常MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)3種片段（Rab17、mRab17、dRab17）的轉(zhuǎn)基因煙草種子與野

9、生型煙草種子發(fā)芽情況基本相同，但在含有甘露醇或氯化鈉的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)Rab17或dRab17煙草種子比野生型煙草種子發(fā)芽時間明顯推遲；轉(zhuǎn)mRab17煙草種子比野生型煙草種子發(fā)芽時間有所提前；轉(zhuǎn)dRab17煙草種子與轉(zhuǎn)Rab17煙草種子發(fā)芽時間相同。
　　 10.兩類煙草幼苗在甘露醇、氯化鈉和低溫脅迫下生長均受到抑制，但野生型煙草受抑制程度最大，過表達3種基因片段（Rab17、mRab17、dRab17）的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗均減輕了