飼喂肉桿菌Hg4-03對(duì)貢嘎蝠蛾幼蟲腸道消化酶及微生物區(qū)系的影響.pdf

1、貢嘎蝠蛾是冬蟲夏草的優(yōu)勢(shì)寄主，其幼蟲被蟲草菌侵染后形成蟲菌復(fù)合體，稱之為冬蟲夏草，它是中國(guó)特產(chǎn)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰等重大藥用和保健功能。貢嘎蝠蛾生活在高海拔草甸土中，近年來(lái)因?yàn)槿祟悓?duì)自然環(huán)境的破壞，同時(shí)在商業(yè)利益的驅(qū)使下不計(jì)后果的采挖，導(dǎo)致這一名貴中藥材的自然資源嚴(yán)重枯竭，為了滿足人們對(duì)冬蟲夏草的需求，人工飼養(yǎng)冬蟲夏草宿主的方式逐漸被采用，但幼蟲成活率低且生長(zhǎng)發(fā)育不良成為制約規(guī)模化養(yǎng)殖幼蟲的瓶頸。
　　 本實(shí)驗(yàn)

2、室通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)鑒定法相結(jié)合的手段，從貢嘎蝠蛾幼蟲腸道內(nèi)篩選到一株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Carnobacterium sp.(肉桿菌 Hg4-03)，并成功分離培養(yǎng)。本研究通過(guò)在貢嘎蝠蛾幼蟲食物中添加該優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，檢測(cè)幼蟲取食后生長(zhǎng)發(fā)育以及腸道主要消化酶活性的變化，同時(shí)分析添加優(yōu)勢(shì)菌后幼蟲腸道菌群多樣性的改變，從而研究?jī)?yōu)勢(shì)菌 Hg4-03對(duì)蝠蛾幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化的影響，希望能找出一種通過(guò)微生態(tài)制劑以改良貢嘎蝠蛾幼蟲養(yǎng)殖效率，為人工培育

3、冬蟲夏草提供技術(shù)支持。研究獲得以下主要結(jié)果：
　　 ①向貢嘎蝠蛾幼蟲食物中添加兩種不同濃度的優(yōu)勢(shì)菌-肉桿菌 Hg4-03 28d后計(jì)算幼蟲的體重增長(zhǎng)率和死亡率。結(jié)果顯示，添加肉桿菌 Hg4-03菌飼喂幼蟲后，幼蟲的體重增長(zhǎng)率(T-2：52.06％; T-1：51.53％)相對(duì)于對(duì)照組(C-1：39.29％)明顯提高，而死亡率則顯著下降(T-2：15.63％; T-1：18.75％; C-2:28.13％; C-1：32.26％

4、)。同時(shí)，飼喂的幼蟲添加的Hg4-03菌濃度越高，幼蟲的增長(zhǎng)率也有升高的趨勢(shì)，但兩個(gè)濃度試驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著差異。
　　 ②飼喂肉桿菌 Hg4-03后分別于14d和28d后解剖幼蟲，取出腸道，加入無(wú)菌水后勻漿，高速離心后取上清，作為粗酶液，利用考馬斯亮藍(lán)的方法測(cè)定粗酶液的總蛋白含量，利用福林—酚法測(cè)定腸道蛋白酶活性，利用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定腸道淀粉酶、纖維素酶和海藻糖酶活性。從檢測(cè)結(jié)果可以看出，添加肉桿菌 Hg4-03菌飼

5、喂的幼蟲腸道消化酶活性有顯著性提高，其中蛋白酶活性與淀粉酶活性增幅最大，纖維素酶活性也有一定提高，但海藻糖酶活性則無(wú)明顯變化。
　　 ③示采用基于16S rDNA基因的DGGE方法，以14d和28d后解剖的幼蟲腸道細(xì)菌總DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)含GC夾通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的16S rDNA序列在變形梯度凝膠中電泳，回收基因片段，連接到PMD18-T載體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM10

6、9中，采用M13載體引物檢測(cè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序。以此計(jì)算各組幼蟲腸道微生物香農(nóng)-威爾指數(shù)，結(jié)果顯示，飼喂肉桿菌Hg4-03后幼蟲腸道菌群的多樣性指數(shù)呈上升趨勢(shì)，處理組幼蟲腸道中肉桿菌Hg4-03含量增加，且處理組中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的量也明顯增加，但兩個(gè)不同濃度菌處理試驗(yàn)組之間差異不顯著。
　　 以上研究結(jié)果顯示，肉桿菌 Hg4-03肉桿菌 Hg4-03作為益生菌飼喂貢嘎蝠蛾幼蟲有助于維持幼蟲腸道菌群