養(yǎng)殖對蝦腸道微生物區(qū)系的特征與功能.pdf

1、隨著藍(lán)色經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展,人們對水產(chǎn)品的需求日益加大,對蝦養(yǎng)殖已成為我國漁業(yè)重要支柱產(chǎn)業(yè)之一,由中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒結(jié)果可知在2010年對蝦類養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到138萬噸,其中凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的養(yǎng)殖產(chǎn)量就達(dá)到122萬噸,占對蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)量的84.5％。但工廠養(yǎng)殖規(guī)模集約化也帶來負(fù)面影響,近幾年頻發(fā)生的細(xì)菌病和病毒病使對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大損失,而抗性藥物的濫用也引起一系列的食品安全問題。目前微生物防控是避免抗性藥物負(fù)

2、面影響的最佳防護(hù)措施。養(yǎng)殖對蝦體內(nèi)外環(huán)境中存在著大量的細(xì)菌類微生物,它們不僅是對蝦食物鏈/網(wǎng)的重要組成環(huán)節(jié),參與養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動,而且在維持生態(tài)平衡及優(yōu)化環(huán)境質(zhì)量方面擔(dān)當(dāng)著重要的角色。益生菌制劑不僅可提高對蝦機(jī)體免疫力,還可改善對蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境。因此了解對蝦腸道微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)特征以及對優(yōu)勢菌株進(jìn)行篩選和鑒定是益生菌應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。本論文研究內(nèi)容主要分為以下七部分:
　　1.養(yǎng)殖對蝦腸道優(yōu)勢菌種的篩選及鑒定:本章通

3、過對蝦腸道優(yōu)勢菌的分離培養(yǎng),菌株16S rDNA測序及比對,研究了工廠化養(yǎng)殖凡納濱對蝦不同月份腸道優(yōu)勢菌的群落特征。結(jié)果顯示:8月份、9月份和10月份腸道菌群均以桿菌和弧菌為主要優(yōu)勢菌。有的菌種在三個月份中都有出現(xiàn)如微小桿菌,有的菌株只在某一月份出現(xiàn)如粘著桿菌只在10月份中出現(xiàn)。
　　2.應(yīng)用PCR-RFLP和PCR-DGGE分析工廠化養(yǎng)殖對蝦腸道微生物群落特征:本章應(yīng)用RFLP和DGGE分析技術(shù)得出8月份對蝦腸道中主要優(yōu)勢菌為U

4、ncultured bacterium,其次為Ruegeria spp.,Vibrio spp.,Rhodobacterales,Streptomyces spp., Enterococcus sp.和 Photobacterium damselae。10月份以 Uncultured bacterium和Vibrio spp.為主要優(yōu)勢菌,其次為 Photobacterium spp., Neptunomonas spp., Strep

5、tomyces spp.,Ruegeria spp.,Enterococcus sp.和Bacillus spp.。利用RFLP和DGGE兩種方法對對蝦腸道樣品進(jìn)行分析都可得到一定微生物多樣性方面的信息,但是二者結(jié)果有差異,將兩者分析結(jié)果綜合考慮,可以形成互補(bǔ),更充分和全面地了解微生物多樣性,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近對蝦腸道的真實(shí)情況。
　　3.哈氏弧菌拮抗菌的篩選與抗菌效果評價:本章采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行體外拮抗試驗(yàn),從健康凡納濱對蝦腸道中

6、篩選出2株對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原菌哈氏弧菌(Vibrio harveyi)生長有抑制作用的海洋細(xì)菌。測定其16S rDNA片段核苷酸序列,將所獲得的序列與GenBanK數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明:具有拮抗作用的2株菌種JK001與交替假單胞桿菌有較高同源性、JK002與Alpha變形桿菌有較高同源性。JK001和JK002免疫對蝦后經(jīng)弧菌感染累計死亡率分別為69.0%、72.2%,而對照組死亡率為100%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、表明JK001和JK002對哈氏弧菌有一定的抑菌作用。
　　4.3株海水芽孢桿菌的鑒定與生物學(xué)特性分析:本章將對蝦腸道中分離的3株菌株進(jìn)行生物學(xué)分析、16S rDNA分子鑒定。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示:所測菌株與芽孢桿菌屬相似度最高,且編號為 KL011001菌株與枯草芽孢桿菌進(jìn)化地位接近,編號為KL011002菌株與短小芽孢桿菌進(jìn)化地位相近,編號為KL011003菌株與地衣芽孢桿菌屬進(jìn)化地位相近。同樣,通過 Biolog碳源利用情

8、況檢測發(fā)現(xiàn),3株菌株對B io lo g碳源利用情況均有差別,因此可判斷3株菌株為不同的細(xì)菌。
　　5.3株共生芽孢桿菌對凡納濱對蝦抗WSSV感染力的影響:本章以3株芽孢桿菌為候選益生菌,采用單一和復(fù)合配伍形式包裹飼料對凡納濱對蝦進(jìn)行免疫,21d后肌肉注射WSSV病毒進(jìn)行感染。通過14d的病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:投喂復(fù)合飼料組、添加枯草芽孢桿菌飼料組、添加地衣芽孢桿菌飼料組、添加短小芽孢桿菌飼料組累積死亡率分別為50%、63.3%、

9、73.3%、75%,較對照組100%累積死亡率差異顯著(P<0.05),其中復(fù)合配伍飼料組(添加有枯草、地衣、短小混合菌的飼料組)較單一飼料組對蝦的累計死亡率有差異顯著(P<0.05),而投喂單一飼料組中的添加地衣芽孢桿菌飼料組較添加枯草芽孢桿菌和添加短小芽孢桿菌飼料組有顯著差異(P<0.05),添加枯草芽孢桿菌飼料組與添加短小芽孢桿菌飼料組之間無顯著差異(P>0.05)。因此復(fù)合飼料組在提高對蝦抗WSSV感染能力上有較好的保護(hù)效應(yīng),在

10、未來對蝦養(yǎng)殖中具有很好的應(yīng)用前景。
　　6.飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦腸道凋亡基因caspase和免疫相關(guān)基因trx表達(dá)量的影響:本章在第5章研究的基礎(chǔ)上,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測在免疫期間和WSSV感染階段各實(shí)驗(yàn)組中凋亡基因caspase和免疫相關(guān)基因trx的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:免疫期間凋亡基因caspase表達(dá)量與對照組相比沒有顯著差異。而實(shí)驗(yàn)組trx表達(dá)量在免疫后1天和3天與對照組相比均具有顯著性差異。且在免疫后第

11、1天表達(dá)量達(dá)到最高。WSSV感染期間復(fù)合飼料組caspase基因表達(dá)量在第6h、18h、96h與對照組相比具有顯著性差異;地衣飼料組caspase基因表達(dá)量在第6h、18h較對照組差異顯著(P<0.05),枯草飼料組與短小飼料組caspase基因表達(dá)量在第18h較對照組差異顯著(P<0.05)。而實(shí)驗(yàn)組trx表達(dá)量在18h、96h、192h時與對照組相比均具有顯著性的增加。
　　7.飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦體內(nèi)WSSV病毒增殖