微生物制劑對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖體系微生態(tài)的影響及其與藻類關(guān)系的研究.pdf

1、南美白對(duì)蝦是目前世界上產(chǎn)值居首位的水產(chǎn)品，中國是全球最大養(yǎng)殖生產(chǎn)國。2014年，中國南美白對(duì)蝦產(chǎn)量157.69萬噸，價(jià)值過千億。南美白對(duì)蝦自1988年引入中國以來，養(yǎng)殖已有27年。隨著育苗技術(shù)和養(yǎng)殖技術(shù)的不斷進(jìn)步，養(yǎng)殖密度越來越大，水環(huán)境問題也越來越嚴(yán)重。為了有效改善水環(huán)境，防控病害，微生態(tài)制劑作為一項(xiàng)生物控制技術(shù)最早引入南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中，并在十余年內(nèi)得到迅速推廣應(yīng)用。由于傳統(tǒng)可培養(yǎng)微生物分析技術(shù)的局限，早期的研究很難從微生態(tài)角度揭

2、示微生態(tài)制劑的作用機(jī)理及其引起的菌群結(jié)構(gòu)變化，而基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的缺乏反過來又制約了微生態(tài)制劑的發(fā)展和應(yīng)用。
　　本文選取實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌FY99-01(Bacillus subtilis FY99-01)粉狀菌劑和硝化桿菌Y3-2(Nitrobacter winogradskyi Y3-2)液體菌劑，在廣西北海進(jìn)行了南美白對(duì)蝦野外全程應(yīng)用試驗(yàn)，在養(yǎng)殖的前、中、后期對(duì)水體和蝦腸道取樣，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和高通

3、量測序技術(shù)，對(duì)上述菌劑在不同養(yǎng)殖時(shí)期使用所造成的養(yǎng)殖水體和蝦腸道總細(xì)菌和弧菌群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以揭示其對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境和蝦腸道微生態(tài)的影響。
　　藻類是水產(chǎn)養(yǎng)殖的關(guān)鍵生態(tài)要素，藻類與細(xì)菌之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，可能影響微生態(tài)制劑作用的發(fā)揮。藻類和硝化細(xì)菌競爭共同底物，尤其是它們決定了氮素的存在形態(tài)和去向，但兩者關(guān)系缺乏系統(tǒng)研究，本文建立了藻-菌相互作用模型，以闡明藻類對(duì)硝化細(xì)菌在養(yǎng)殖水體中發(fā)揮作用的影響。
　　本

4、文主要研究結(jié)論如下:
　　(1)枯草芽孢桿菌FY99-01在蝦池的使用可以明顯改善蝦池水質(zhì)，在養(yǎng)殖前期(0～30天)顯著降低水體pH，中后期（30～84天）降低水體SOP（可溶性正磷酸鹽）濃度，后期（60～84天）降低水體亞硝酸濃度;其對(duì)對(duì)蝦生長速度、對(duì)蝦產(chǎn)量、飼料系數(shù)方面也表現(xiàn)出一定促進(jìn)作用。硝化桿菌Y3-2的作用明顯弱于枯草芽孢桿菌FY99-01，對(duì)水質(zhì)和對(duì)蝦生長促進(jìn)作用改善不大，尤其是沒有表現(xiàn)出降低和控制亞硝酸鹽的作用。

5、r>　　(2)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體不同時(shí)期的優(yōu)勢菌群不同。養(yǎng)殖前期，優(yōu)勢菌群為β-proteobacteria和Verrucomicrobiae;養(yǎng)殖中期，為α-proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobiae、Cyanobacteria及Bacilli;養(yǎng)殖后期，為α-proteobacteria（30.46±7.70％）、γ-proteobacteria（12.72±4.11％）、Chlorapl

6、ast（7.16±3.22％)、Actinobacteria（7.10±3.55％）、Flavobacteria(6.32±2.34％)、Cyanobacteria(5.52±8.87％)、β-proteobacteria(4.30±1.42％)、Sphingobacteria(4.03±1.39％)、Planctomycetacia(3.30±0.46％)、δ-proteobacteria(2.57±0.60％)以及Verrucomi

7、crobiae（1.55±0.74％）等。
　　(3)南美白對(duì)蝦腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌群為γ-proteobacteria（60.77±16.51％）、α-proteobacteria(15.45±8.98％)、Sphingobacteria(4.01±2.16％)、Actinobacteria(3.83±3.75％)、Flavobacteria（3.80±0.69％）及Planctomycetacia（1.00±0.60％）等?；【菍?duì)

8、蝦腸道菌群最常見種群之一，其主要種類為Vibrio shilonii、V.hepatarius和一種不可培養(yǎng)弧菌(Uncultured Vibrio sp.，AY374396.1);值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)浮霉菌綱Planctomycetacia也是蝦腸道的優(yōu)勢種群，值得關(guān)注，因?yàn)槟壳罢J(rèn)為厭氧氨氧化菌（Anammox）主要來自該菌群，它們?cè)诘厍虻h(huán)中有重要生態(tài)意義。
　　(4)投加枯草芽孢桿菌FY99-01和硝化桿菌Y3-2均對(duì)

9、水體總細(xì)菌微生態(tài)產(chǎn)生影響，芽孢桿菌的影響大于硝化桿菌?；贒GGE的聚類結(jié)果表明:芽孢桿菌在前期和中期的影響大于其后期的影響。DGGE切膠測序結(jié)果顯示:前期，投加芽孢桿菌使一種人類病原菌WP01(Klebsiellapneumoniae MP3_1A，JN644624.1)和一種不可培養(yǎng)細(xì)菌WP03(Uncultured organism SBXY_796，JN429468.1)比例降低，使芽孢桿菌WP02(KM083138)比例明顯增

10、加，投加硝化細(xì)菌同樣使WP01比例降低;中期，投加芽孢桿菌使一種放線菌綱細(xì)菌WM08(Cryobacterium psychrotolerans，JN626519.1)、一種藍(lán)細(xì)菌WM09(Leptolyngbyafragilis，EF420112.1)和一種疣微菌綱細(xì)菌WM11(UncukuredVerrucomicrobiales bacterium，F(xiàn)J516959.1)在水體中出現(xiàn)，使一種人類病原菌WM10(Acinetobac

11、ter radioresistens SMA4，JQ618289.1)消亡，投加硝化細(xì)菌也使WM08和WM09出現(xiàn)，使WM10比例降低;后期，投加芽孢桿菌使不可培養(yǎng)疣微菌綱細(xì)菌WA01、WA03和WA07比例降低或消亡，使一種芽孢桿菌WA12比例增加;投加硝化細(xì)菌使疣微菌綱細(xì)菌WA03、WA11和一種芽孢桿菌綱反硝化細(xì)菌WA04比例降低;后期，高通量測序結(jié)果同樣顯示，投加枯草芽孢桿菌FY99-01會(huì)使水體中α-proteobacteri

12、a細(xì)菌比例明顯降低(P＜0.05），而Flavobacteria、Cyanobacteria、Bacilli以及綠藻比例明顯上升，屬水平上使Bacillus spp.比例顯著上升(P＜0.05);而投加硝化桿菌Y3-2影響較小，優(yōu)勢種群中僅發(fā)現(xiàn)綠藻含量有大幅上升。整體上，投加微生態(tài)制劑優(yōu)化了養(yǎng)殖水環(huán)境的微生態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　(5)在水體中使用微生態(tài)制劑會(huì)影響蝦腸道的微生物群落結(jié)構(gòu)，枯草芽孢桿菌FY99-01和硝化桿菌Y3-2均明顯提高

13、了蝦腸道總細(xì)菌的多樣性?？莶菅挎邨U菌FY99-01的使用導(dǎo)致蝦腸道內(nèi)陽brio spp.（特別是潛在病原菌V.parahaemolyticus）、Rhodobacterspp.比例明顯減少，Pseudomonas spp.、Corynebacterium spp.比例明顯增多。硝化桿菌Y3-2的使用同樣導(dǎo)致Vibrio spp.減少，Pseudomonas spp.以及Chitinophaga spp.比例明顯增加。這從微生態(tài)角度說明了

14、使用本文的微生態(tài)制劑對(duì)對(duì)蝦健康的改善潛力和其安全性。
　　(6)藻類的生長會(huì)明顯抑制硝化細(xì)菌的硝化作用，光線同樣抑制其硝化作用，藻和光的共同作用會(huì)使抑制作用增強(qiáng)。藻主要抑制硝化細(xì)菌生長，而光主要抑制硝化細(xì)菌活性。硝化細(xì)菌制劑在養(yǎng)殖水體中應(yīng)用效果不佳的主要原因是藻類生長和光照的聯(lián)合抑制作用。
　　(7)銅綠微囊藻FACHB-915通過氨氮利用的優(yōu)勢抑制硝化細(xì)菌的生長和活性;微囊藻毒素MC-LR對(duì)硝化細(xì)菌的生長和活性沒有影響，微