貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道微生物區(qū)系的研究.pdf

1、貢嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis)幼蟲(chóng)是名貴中藥材冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)的優(yōu)勢(shì)寄主之一。在冬蟲(chóng)夏草人工培植中蝠蛾幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)是基礎(chǔ)。但目前人工養(yǎng)殖蝠蛾幼蟲(chóng)中幼蟲(chóng)抗逆力弱，易受微生物感染，是影響冬蟲(chóng)夏草資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)的重要制約因子。研究貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道菌群多樣性，對(duì)于研究其營(yíng)養(yǎng)生理，進(jìn)而改善和研制蝠蛾人工飼料，提高幼蟲(chóng)抗逆力和成活率有重要意義。
　　本研究以四川康定雅家埂山上采集的貢嘎蝠蛾為

2、實(shí)驗(yàn)材料，利用傳統(tǒng)分離純化技術(shù)與分子生物學(xué)方法研究了貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道微生物多樣性。用傳統(tǒng)的分離純化，以及生理生化鑒定的結(jié)果顯示，貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道中共分離出12種不同的細(xì)菌,經(jīng)鑒定分屬于8個(gè)屬。貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道中還存在3種不同的真菌，分別是隱球酵母（Cryptococcus magnus）、Geomyces sp和絲孢酵母（Trichosporon porosum）3個(gè)類(lèi)群的真菌。
　　首先，采用基于16S rRNA基因的RFLP（

3、Restriction Fragment Length Polymorphism）法，通過(guò)保守序列設(shè)計(jì)引物對(duì)貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增得到的16S rRNA序列連接到PMD18-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，建立16S rRNA克隆文庫(kù)。用限制性?xún)?nèi)切酶EocRI、MspI和HaeⅢ對(duì)16S rRNA克隆文庫(kù)中的204個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，結(jié)果顯示有有35個(gè)不同的RFLP操作分類(lèi)單元（

4、OTU）。其次，采用基于ITS（internal transcribed spacer）基因的RFLP方法，以貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道真菌的總DNA為模板，用真菌ITS區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道真菌的ITS克隆文庫(kù)，分別用MspI、HaeⅢ和TaqI對(duì)205個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒酶切指紋圖譜分析，結(jié)果顯示有23個(gè)不同的RFLP操作分類(lèi)單元。因?yàn)槊糠N圖譜很可能就代表一個(gè)不同的微生物種群，所以通過(guò)分析 RFLP圖譜，即可相應(yīng)反映出該環(huán)

5、境中微生物種類(lèi)的數(shù)量及群落中的優(yōu)勢(shì)菌群。
　　把RFLP分析得到的35種有差異的16S rRNA酶切圖譜以及23種有差異的ITS酶切圖譜的克隆進(jìn)行測(cè)序。并對(duì)所得序列以分子信息技術(shù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明：共有11個(gè)不同屬的細(xì)菌存在于貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道中，其中有15個(gè)操作單元都代表Rahnella sp，9個(gè)操作單元都代表Carnobacterium sp，這兩種菌屬分別占總16S rRNA克隆文庫(kù)的45.58％和30.88%；共

6、有8個(gè)不同屬的真菌存在于貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道中，其中被孢霉屬（Mortierella）和絲孢酵母屬（Trichosporon）的豐度最高，分別占克隆文庫(kù)的46.34%和40.00%，鑒定為腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群。
　　結(jié)果顯示，貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道中存在著大量的細(xì)菌和真菌，它們的種類(lèi)和數(shù)量各不相同，即貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道中具有豐富的微生物多樣性。此方法對(duì)貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)腸道微生物進(jìn)行研究將是可行的。在RFLP法與純培養(yǎng)的比較研究中，兩種方法檢測(cè)到的