番茄潰瘍病菌的分子檢測及其生防鏈霉菌Z-L-22的研究.pdf

1、番茄潰瘍病(Bacterial canker of tomato)是番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害之一，病原菌為密執(zhí)安棒狀桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)。該病自從1909年首次在美國密執(zhí)安州的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來，發(fā)生頻繁，現(xiàn)已廣泛分布于世界各番茄產(chǎn)區(qū)。近年來在我國的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，被列入我國檢疫對(duì)

2、象的名單。Cmm可隨帶病種子、病苗、病殘?bào)w及土壤傳播，形成初侵染，國內(nèi)外尚無防治該病的有效方法。已報(bào)道的一些措施僅局限在一定程度上控制病害的發(fā)生和蔓延。因此建立靈敏可靠的檢測措施和開發(fā)有效的防治方法對(duì)于控制該病害的發(fā)生和發(fā)展有重要的意義。本研究建立了以寄主為內(nèi)參的番茄潰瘍病菌多重PCR檢測方法，并從生物防治的角度出發(fā)對(duì)番茄潰瘍病菌拮抗菌株西唐鏈霉菌Z-L-22進(jìn)行了研究。
　　 1.針對(duì)PCR檢測中可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果，建立了以

3、番茄DNA為內(nèi)參，檢測番茄植株和種子中番茄潰瘍病菌的多元PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系中加入針對(duì)番茄潰瘍病菌ITS基因區(qū)域特異性引物PSA-4/PSA-R和針對(duì)番茄17SrRNA的特異性引物FNS-7-F/NS-8-R，以及病菌和番茄DNA進(jìn)行擴(kuò)增。在特異、靈敏檢測病原菌擴(kuò)增的同時(shí)還增加了基于番茄基因保守區(qū)域進(jìn)行的內(nèi)參反應(yīng)來檢測擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。采用該引物組合可從病菌和番茄混合DNA中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。優(yōu)化了兩引物加入的比例、濃度、擴(kuò)增的

4、退火溫度，優(yōu)化后的反應(yīng)體系檢測靈敏度可達(dá)5×102cfu/mL。應(yīng)用該體系可以在針刺法接種后6d未顯癥植株和5×104cfu/mL菌懸液浸泡的種子人工模擬帶菌種子中檢測到病原菌，有效地減少擴(kuò)增中的假陰性結(jié)果。
　　 2.在溫室條件下對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的番茄潰瘍病菌拮抗菌西唐鏈霉菌Z-L-22對(duì)番茄潰瘍病的防治效果進(jìn)行了研究。采用土壤混入病原菌接種的方法，對(duì)西唐鏈霉菌Z-L-22及其代謝產(chǎn)物采取了活菌拌種、發(fā)酵濾液浸種和土壤中接入拮抗

5、菌3方法進(jìn)行施藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活菌拌種效果最好，其次是土壤中接入拮抗菌，最后是發(fā)酵濾液浸種，防效分別為70.5％、67.9％和43.2％。該結(jié)果為利用該菌株進(jìn)行田間防治番茄潰瘍病提供了依據(jù)。
　　 3.對(duì)于番茄潰瘍病菌拮抗菌株西唐鏈霉菌(Streptomyces setonii)Z-L-22進(jìn)行了活性物質(zhì)研究。使用薄層層析(展層劑為苯：乙酸乙酯：甲醇=19：19：4)對(duì)發(fā)酵液萃取物進(jìn)行分離，對(duì)分離的Rf值為0.64和0.56兩個(gè)主

6、要活性成分回收。采用Doskochilova八溶劑系統(tǒng)紙層析方法，得到這兩種成分在不同溶劑中的Rf值，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比，確定這兩種物質(zhì)都為放線菌素類抗生素。利用放線菌素類抗生素合成酶保守引物在該菌基因組中擴(kuò)增到770bp的相關(guān)基因片段(基因登錄號(hào)為：FJ767838)，序列分析結(jié)果顯示與金羊毛鏈霉菌(Streptomyces chrysomallus)放線菌素合成酶Ⅲ(actinomycin synthctase Ⅲ，acmC)基因(基因

7、登錄號(hào)為：AF204401.1)有82％的相似性。表明該菌株中含有放線菌素合成酶相關(guān)基因，進(jìn)一步證實(shí)了該菌產(chǎn)生抗生素的類別，也為在基因水平上研究該菌的抗生素合成奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.使用染色體步移技術(shù)對(duì)西唐鏈霉菌Z-L-22基因組中已得到的770bp放線菌素合成相關(guān)片段進(jìn)行延伸。試驗(yàn)中改進(jìn)了染色體步移的方法，命名為非特異性錨定引物PCR方法(Nonspccifie Primer Anchored PCR，NPA-PCR)。從已

8、知序列設(shè)計(jì)基因特異性嵌套引物，用含有簡并堿基的長隨機(jī)引物為非特異錨定引物，通過調(diào)節(jié)退火溫度來控制引物與模板的復(fù)性，使隨機(jī)引物非特異性的與模板結(jié)合，起到目的序列端錨定的作用，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的區(qū)域的擴(kuò)增：而非特異擴(kuò)增序列由于兩端都結(jié)合有同樣的隨機(jī)引物，在退火時(shí)形成鍋餅結(jié)構(gòu)抑止了擴(kuò)增。應(yīng)用NPA-PCR方法對(duì)已得到的基因片段進(jìn)行染色體步移，在已有片段上游和下游分別延伸了1474bp和701bp，在NCBIBlastn上比對(duì)，延伸片斷與原有片斷在同

9、一基因簇中比鄰，為目的擴(kuò)增，證明了該方法的可行性。把得到的5’端延伸序列、3’端延伸序列及原序列拼接后得到2716bp的基因片段，在GenBank上比對(duì)，與Streptomyces chrysomallus放線菌素合成酶Ⅲ基因(acmC)有79％相似性。
　　 5.用NCBI上的Flameplot軟件分析克隆到的西唐鏈霉菌Z-L-22rp2716bp放線菌素合成相關(guān)片段，有一個(gè)1683bp的開放閱讀框，命名為ssaX(Strep