曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及免疫學(xué)篩選.pdf

1、曼氏迭宮絳蟲(chóng)病是由絳蟲(chóng)綱，假葉目，雙葉槽科的曼氏迭宮絳蟲(chóng)寄生于犬、貓等多種動(dòng)物的肌肉、皮下、胸腹腔等處引起的一種寄生蟲(chóng)病。曼氏裂頭蚴病是由曼氏迭宮絳蟲(chóng)的中絳期-裂頭蚴（Sparganum）于人體寄生所致，該病可歸納為以下幾種，即眼裂頭蚴病、皮下裂頭蚴病、口腔頜面部裂頭蚴病、腦裂頭蚴病以及增殖型裂頭蚴病。該病在我國(guó)分布廣泛，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，是一種重要的人畜共患病。目前關(guān)于本病的免疫預(yù)防研究還較少，為

2、此本研究首先建立了曼氏裂頭蚴的eDNA文庫(kù)，然后利用免疫學(xué)篩選獲得了2個(gè)持續(xù)陽(yáng)性的克隆子并進(jìn)行了序列測(cè)定與功能預(yù)測(cè)，主要的研究結(jié)果如下：
　　 1、曼氏裂頭蚴的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　 以TRIZOL試劑提取的曼氏裂頭蚴總RNA為模板，以含SfiⅠ B酶切位點(diǎn)的oligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用LD-PCR技術(shù)以改良的oligo（dT）引物合成雙鏈cDNA，經(jīng)蛋白酶K和SfiⅠ消化后，過(guò)CHROMA

3、SPIN-400柱進(jìn)行分級(jí)分離。雙鏈cDNA與載體λTrip-Ex2兩臂連接，體外包裝后構(gòu)建成曼氏裂頭蚴的cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)。經(jīng)測(cè)定文庫(kù)容量為：初始文庫(kù)的滴度為1.04×106 pfu/mL，擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為7.8×108pfu/mL，結(jié)果表明：成功的構(gòu)建了曼氏裂頭蚴cDNA文庫(kù)。
　　 2、曼氏裂頭蚴的cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選
　　 利用制備的經(jīng)過(guò)去除大腸桿菌抗體后的感染曼氏裂頭蚴的人的陽(yáng)性血清對(duì)已構(gòu)建的曼氏裂頭蚴

4、cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，篩選了大約2.0×104個(gè)重組的噬菌體，共獲得12個(gè)初篩陽(yáng)性克隆。將初篩陽(yáng)性克隆進(jìn)行了3次復(fù)篩，直至全部反應(yīng)陽(yáng)性，共獲得2個(gè)持續(xù)陽(yáng)性反應(yīng)的克隆子分別編號(hào)W1和W2，將編號(hào)為W1和W2的兩個(gè)陽(yáng)性克隆子經(jīng)噬菌體λTriplE×2轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒載體pTriplE×2后，插入序列經(jīng)自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定后，序列送BLAST服務(wù)站進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)W1和W2基因分別為與增殖裂頭蚴SOD（超氧化物歧化酶）基因同源性96％，與增殖裂頭