OsMKK1、OsMPK4調(diào)節(jié)水稻的鹽脅迫反應(yīng)及SS12鹽敏感突變體的篩選和初步定位.pdf

1、土壤的鹽堿化已成為公認(rèn)的影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重問(wèn)題，全世界大約有1/5的農(nóng)田都受高鹽堿化影響。土壤的鹽堿化會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，主要通過(guò)滲透脅迫、離子平衡和離子毒害等，其中離子毒害主要是鈉離子引起的。但是植物是如何感受鹽脅迫和整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑我們了解的還很少。利用突變體來(lái)研究某些基因在這個(gè)過(guò)程中的作用，是很重要的手段。
　　1.在植物中MAPK信號(hào)通路廣泛參與了脅迫信號(hào)。首先利用熒光定量PCR對(duì)OsMKK家族中的7個(gè)成員進(jìn)行鹽脅迫下

2、0-8小時(shí)的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)OsMKK1在鹽處理一小時(shí)后表達(dá)量變化很大。選取了OsMKK1作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)比osmkk1突變體和野生型經(jīng)過(guò)鹽處理后地上部的鈉離子含量及存活率的變化發(fā)現(xiàn)，水稻osmkk1突變體變得對(duì)鹽脅迫非常敏感，地上部積累了更高的鈉離子，當(dāng)鹽處理7天后，復(fù)水7天，與野生型相比osmkk1突變體存活率非常低。
　　選取3個(gè)能夠被鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的MPK基因，即OsMPK3，OsMPK4和OsMPK7，在原核中表達(dá)，并

3、用它們作為底物測(cè)定原生質(zhì)體中OsMKK1的活性，發(fā)現(xiàn)OsMPK3，OsMPK4都能被OsMKK1激活。OsMPK4也在以后的實(shí)驗(yàn)中被選作底物來(lái)測(cè)定OsMKK1的活性。在原生質(zhì)體中表達(dá)帶Flag標(biāo)簽的OsMKK1，然后利用Flag抗體免疫共沉淀出OsMKK1利用GST-OsMPK4作為底物測(cè)定OsMKK1在原生質(zhì)體鹽處理10分鐘的活性，發(fā)現(xiàn)它的活性顯著增高。用OsMKK1抗體從鹽處理后的水稻幼苗中免疫共沉淀出OsMKK1，測(cè)定植株中的Os

4、MKK1活性在鹽脅迫下的變化，發(fā)現(xiàn)鹽處理OsMKK1活性跟在原生質(zhì)體中的結(jié)果一致，都出現(xiàn)了顯著地升高，并且還在2個(gè)小時(shí)內(nèi)保持著高活性。
　　通過(guò)酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，OsMPK4是OsMKK1的一個(gè)作用靶蛋白，并且有很強(qiáng)的相互作用。利用酵母MPKK突變體pbs2來(lái)進(jìn)行酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OsMKK1及其下游的OsMPK4能夠一起互補(bǔ)酵母突變體pbs2中MPKK基因缺失所導(dǎo)致的鹽敏感表型。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)只有OsMPK4或OsMKK1單獨(dú)表達(dá)時(shí)

5、是不能互補(bǔ)表型的，這表明OsMPK4和OsMKK1有相互作用，OsMPK4是依靠OsMKK1來(lái)起作用的。
　　為了探尋OsMPK4與鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的作用，測(cè)定了原生質(zhì)體和植株中OsMPK4的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsMPK4也能被鹽脅迫激活，并且在osmkk1突變體中OsMPK4活性提高所保持的時(shí)間更短。在原生質(zhì)體中過(guò)表達(dá)OsMKK1能夠增加OsMPK4的活性。
　　MPK基因在植物逆境中的作用的研究早就發(fā)現(xiàn)能夠影響基因的表達(dá)，其

6、中包括轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了在鹽脅迫下幾個(gè)逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子OsDREB2A,OsDREB2B,OsNAC6,OsTRAB1,OsABI5,OsbZIP23和OsMYBS3在野生型和突變體osmkk1中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsMYB3S，OsNAC6，OsDREB2B和OsDREB2A在突變體中的表達(dá)升高受到了抑制。
　　綜上所述，OsMKK1和OsMPK4組成的信號(hào)通路參與了水稻鹽脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且調(diào)節(jié)了水稻對(duì)鹽

7、脅迫的抵抗能力。
　　2.利用化學(xué)誘變劑EMS制作日本晴背景的突變體，并從中篩選鹽敏感突變體，然后利用圖位克隆技術(shù)進(jìn)行定位。
　　本研究利用粳稻測(cè)序品種日本晴，用EMS作為誘變劑。從突變體庫(kù)中篩選得到一份對(duì)鹽敏感的突變體材料SS12(saltsensitive12)，對(duì)其進(jìn)行鹽處理后發(fā)現(xiàn)，SS12在鹽脅迫下葉尖很快萎蔫變黃，同時(shí)通過(guò)測(cè)定幼苗體內(nèi)的鈉鉀離子含量發(fā)現(xiàn)，SS12能夠在地上部積累更多的鈉離子和鉀離子，在地下部差異不明

8、顯。通過(guò)比較SS12和野生型傷流中的鈉鉀離子含量發(fā)現(xiàn)，SS12在傷流中的鈉離子含量也比野生型明顯上升。這說(shuō)明了突變體SS12能夠在地上部積累高濃度的鈉離子可能與能夠往地上部運(yùn)輸更多的鈉離子有關(guān)。
　　通過(guò)分析掃描電鏡X射線能譜發(fā)現(xiàn)，鹽處理后，在SS12根、葉中的的薄壁組織和木質(zhì)部中，鉀元素并沒(méi)有像野生型中下降的那么明顯。分析掃描電鏡的掃描圖片發(fā)現(xiàn)，SS12幼苗根部的次生木質(zhì)部的數(shù)量上有明顯差異，SS12次生木質(zhì)部只有1根導(dǎo)管，而野

9、生型絕大部分次生木質(zhì)部有2根導(dǎo)管。
　　利用基因芯片分析了鹽處理前后，野生型和突變體體內(nèi)基因表達(dá)的變化。分地上部和地下部來(lái)取樣。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，野生型和突變體基因表達(dá)的差異主要集中在地下部。對(duì)地下部的表達(dá)差異進(jìn)行GO(GeneOntology)的富集分析。富集較多差異基因GO種類(lèi)比較相似。針對(duì)鹽處理前后，突變體比野生型根部表達(dá)都上升的80個(gè)基因和都下降的109個(gè)基因進(jìn)行了重點(diǎn)的分析，對(duì)變化的一部分基因編號(hào)和功能進(jìn)行了進(jìn)一步的闡釋?zhuān)Y(jié)

10、果發(fā)現(xiàn)跟激素合成比如赤霉素GA合成相關(guān)的一部分基因，PCD相關(guān)基因，POD類(lèi)基因，萌蛋白類(lèi)的基因和細(xì)胞壁受體激酶WAK類(lèi)的基因都多次出現(xiàn)。對(duì)這些基因分析發(fā)現(xiàn)他們很多都可能與次生木質(zhì)部的形成有關(guān)。
　　利用SS12/明恢63和SS12/窄葉青8號(hào)的雜交組合F2∶3后代進(jìn)行初定位，從SS12和/明恢63的F2∶3群體中250個(gè)株系利用檢測(cè)到有多態(tài)的140對(duì)SSR引物對(duì)親本SS12及明恢63窄葉青8的全基因進(jìn)行掃描，尋找與鈉離子含量連鎖