OsMKK1和OsMKK6基因在水稻多重抗性中的功能研究.pdf

1、MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）級聯(lián)途徑是廣泛存在于真核生物中一種高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPK級聯(lián)途徑及其調(diào)控的基因影響植物對生物和非生物逆境的多抗性。低溫、干旱和鹽害等逆境嚴(yán)重影響了水稻生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，通過酵母雙雜交、體外磷酸化檢測和功能驗證等方法鑒定了參與水稻冷害信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的OsMKK6-OsMPK3途徑，參與水稻鹽害信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的OsMKK1-OsMPK4途徑。但是，其下游靶蛋白及其作用機制還不明確。本研究利用BiFC、

2、酵母雙雜交體系和MAPK磷酸化檢測方法，證實了OsMKK1，OsMKK6分別與OsMPK3，OsMPK4和OsMPK6之間的互作特異性。而且，創(chuàng)建了OsMKK1和OsMKK6基因的超表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，初步研究了它們的抗性功能。本文主要結(jié)果如下:
　　1.OsMKK1和OsMKK6在原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位。將pD1301S-EGFP-MKK1、pD1301S-EGFP-MKK6融合蛋白基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體。熒

3、光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，OsMKK1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針mCherry-HDEL完全重合;OsMKK6定位在細(xì)胞質(zhì)中;而對照GFP蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中都有表達(dá)。
　　2.雙分子熒光互補實驗證明，OsMKK1與OsMPK3，OsMPK4在水稻原生質(zhì)體中互作;OsMKK6與OsMPK3，OsMPK4在水稻原生質(zhì)體中互作。酵母雙雜交實驗證明，OsMKK1與OsMPK4，OsMPK6互作，OsMKK6與OsMPK4互作。

4、
　　3.OsMKK1和OsMKK6蛋白的原核誘導(dǎo)和激酶活性檢測。在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)His-OsMKK1和His-OsMKK6-SUMO融合蛋白。體外磷酸化檢測表明，OsMKK1和OsMKK6具有自磷酸化活性。利用體外點突變PCR構(gòu)建了GST-MPK3-M、GST-MPK4-M和GST-MPK6-M自磷酸化失活的融合蛋白基因表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)GST-MPK3-M，GST-MPK4-M和GST-MPK

5、6-M融合蛋白。體外磷酸化與Phos-tag-gel SDS-PAGE技術(shù)證明了GST-MPK3-M，GST-MPK4-M和GST-MPK6-M融合蛋白沒有自磷酸化活性，可以用于與OsMKK1，OsMKK6激酶互作研究。
　　4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了OsMKK1和OsMKK6基因超表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻。繁殖加代，潮霉素篩選獲得了T4轉(zhuǎn)基因純合株系。
　　5.OsMKK1和OsMKK6轉(zhuǎn)基因水稻萌發(fā)期的耐冷性鑒定。12℃

6、低溫處理12 d，OsMKK1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻幼芽生長速度比野生型快，可溶性糖積累大于野生型;OsMKK6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻幼芽生長速度大于野生型。
　　6.OsMKK1轉(zhuǎn)基因水稻苗期的耐冷性鑒定。低溫處理三葉期水稻幼苗，OsMKK1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗存活率高于野生型，可溶性糖積累大于野生型。超表達(dá)OsMKK1增強水稻苗期的耐冷性。
　　7.OsMKK6轉(zhuǎn)基因水稻苗期的耐鹽性鑒定。150 mM NaCl脅迫處理下，OsMKK