水稻冷脅迫應答miR156k的克隆與耐冷功能分析.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食作物之一。低溫冷害是影響高寒地區(qū)水稻農業(yè)生產亟待解決的重要環(huán)境因素，萌發(fā)期和苗期冷害使種子萌發(fā)緩慢、發(fā)育不良、分蘗數減少，導致水稻減產或絕收，從而嚴重影響水稻產量、品質與地理分布。因此了解和揭示水稻早期耐低溫分子機理、獲得冷脅迫信號通路關鍵基因、以期通過基因工程手段改良水稻耐冷性和選育水稻耐冷新品種，是增加水稻產量、解決水稻冷害問題對世界食物安全具有十分重要的現實意義。
　　

2、MicroRNA(miRNA)是一類長為21nt左右的單鏈RNA，在真核生物中廣泛存在，具有調控其靶基因表達從而調節(jié)植物生長發(fā)育、抗逆、代謝等生命過程的功能。miR156k被證明在擬南芥、水稻、玉米以及番茄等植物中參與生長發(fā)育的調控，在前期的研究中通過基因芯片分析發(fā)現，水稻miR156k在苗期冷脅迫中差異表達，后通過real-time PCR分析miR156k表達特性，驗證了芯片分析結果，從而推測miR156k在水稻響應冷脅迫時發(fā)揮作用

3、。
　　本研究通過構建pre-miR156k水稻遺傳表達載體，對水稻進行遺傳轉化，獲得了pre-miR156k Southern陽性超量表達水稻植株。通過對野生型和超量表達水稻植株萌發(fā)期和幼苗期進行冷脅迫處理，研究miR156k在冷脅迫中的功能。利用psRNA Target軟件預測miR156k靶基因，通過查找相關文獻確定軟件預測結果的準確性，并利用miR156k超量表達植株進行real-time PCR分析其靶基因在冷脅迫下的表

4、達模式。進一步通過分析miR156k超量表達植株中冷脅迫Marker基因表達特性、脯氨酸及SOD含量，初步探討了miR156k水稻冷脅迫反應的分子機制。主要研究結果如下:
　　(1) pre-miR156k在水稻中的過量表達
　　本研究采用農桿菌介導的方法將pre-miR156k表達載體對水稻愈傷組織進行遺傳轉化，并獲得固沙草抗性的水稻植株。通過PCR、southern blot的方法對抗性植株進行了分子生物學檢測，獲得轉p

5、re-miR156k植株。
　　(2) miR156k的耐冷功能分析
　　對Southern陽性的超量表達miR156k T2代轉基因水稻及野生型水稻植株在萌發(fā)期進行4℃冷脅迫處理，結果表明:miR156k轉基因植株與野生型植株種子大小及在對照組均無差異;在冷處理后，野生型水稻萌發(fā)率、地上部分長度及根長都明顯優(yōu)于轉基因水稻。對轉miR156k水稻T2代3葉期幼苗進行4℃冷脅迫處理，結果表明:超量表達miR156k降低了轉基因

6、水稻對冷脅迫的耐性，冷脅迫24h后轉miR156k水稻的葉卷率高于野生型，而SOD的活性、葉綠素含量和脯氨酸含量在冷脅迫下轉基因水稻均明顯低于野生型。
　　(3)初步分析miR156k參與的冷脅迫應答分子機制
　　通過對轉miR156k水稻和未轉基因水稻冷脅迫相關Marker基因的表達模式分析，在冷脅迫下一些冷脅迫相關的Marker基因如脯氨酸合成基因OsP5CS，ROS清除基因Os01g22249在轉miR156k水稻中在

7、冷脅迫中表達量有所提高。以上表明超量表達miR156k降低了冷脅迫相關Marker基因及其靶基因的表達量，從而增加了水稻對冷脅迫的敏感性。通過相關文獻查找，我們得到了19個miR156k的靶基因。首先實驗室前期通過芯片數據分析了這些靶基因的表達特性，為了進一步驗證SPL基因的表達量受冷脅迫影響，我們選擇了其中的三個基因(SPL3、SPL14和SPL17)進行了表達特性分析。結果表明在9h野生型和轉基因水稻中的SPL基因表達量的差異明顯。