藍(lán)狐細(xì)小病毒泰安株分子生物學(xué)特征研究及其TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、本研究從泰安地區(qū)某藍(lán)狐養(yǎng)殖場送檢的疑是感染細(xì)小病毒的藍(lán)狐病料中分離到一株細(xì)小病毒。經(jīng)常規(guī)病毒學(xué)方法及分子病毒學(xué)方法鑒定，所分離到的細(xì)小病毒為藍(lán)狐細(xì)小病毒(Blue fox parvovirus，BFPV)，命名為BFPV-TA。采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其VP1、VP2、NS1基因進(jìn)行克隆和序列分析，并建立了BFPV熒光定量PCR檢測方法。 1.采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用F81細(xì)胞，從疑是細(xì)小病毒感染的藍(lán)狐病料中分離到一株細(xì)小病毒，該

2、病毒可以在F81細(xì)胞上產(chǎn)生BFPV樣病變，經(jīng)理化特性鑒定、血凝譜鑒定、人工感染藍(lán)狐以及分子病毒學(xué)技術(shù)鑒定，證實(shí)所分離病毒為BFPV，將BFPV泰安分離株命名為BFPV-TA。 2.根據(jù)GenBank上發(fā)表的犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)與貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)核酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP1、NS1基因的引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增其VP1、NS1全基因，將PCR產(chǎn)物克隆入pMD1

3、8-T載體，進(jìn)行測序分析。結(jié)果，BFPV-TA VP1基因全長2256 bp，編碼727個(gè)氨基酸，與CPV和FPV參照株的VP1基因同源性在98.7％-99.5％之間。BFPV-TA VP1蛋白375位氨基酸殘基與CPV的VP1蛋白氨基酸殘基一致，但其223位、236位、246位、466位、707位、711位氨基酸殘基與FPV VP1蛋白的氨基酸殘基一致，BFPV-TAVP1蛋白序列表現(xiàn)出了過渡型序列特征：VP2是構(gòu)成BFPV衣殼蛋白的

4、主要成分，VP2位于VP1的C端，VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重疊，且二者終止于同一密碼子，并且VP1的N端比VP2多154個(gè)氨基酸。VP2基因含有1個(gè)ORF，全長1755bp，共編碼584個(gè)氨基酸，3個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變，219I→V、300G→P、411E→A。BFPV-TA VP2基因與CPV和FPV參照株的同源性在98.5％-99.4％之間；BFPV-TA NS1基因含有1個(gè)ORF，全長2007bp，共

5、編碼668個(gè)氨基酸，8個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變，43R→H，135H→Y，172K→R，179A→E，350D→N，409I→V，574I→V，616D→V。BFPV-TANS1基因與CPV和FPV參照株的同源性分別為98.6％-99.2％之間。VP1、VP2基因系統(tǒng)發(fā)生分析表明BFPV-TA與FPV的親源關(guān)系較為密切；但NS1基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果，BFPV-TA成單獨(dú)的分支。通過對(duì)BFPV-TAVP1、VP2和NS1基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)

6、生分析表明，BFPV-TA是介于FPV與CPV間的過度類型，說明狐貍可能在CPV的起源過程起到重要的作用。 3.根據(jù)BFPV VP2基因的保守基因序列設(shè)計(jì)合成了引物和探針，對(duì)熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了BFPV的TaqMan熒光定量PCR檢測方法。用該方法對(duì)遼寧、山東等地的疑是藍(lán)狐細(xì)小病毒的病料進(jìn)行了檢測。結(jié)果，該方法的陽性檢出率最高，并且與VI、HA和常規(guī)PCR檢測方法的陽性符合率為100％。試驗(yàn)證明，該方法具有