BLG調(diào)控區(qū)指導(dǎo)hLF基因在GMECs、SP2-0和雜交瘤細胞中表達的研究.pdf

1、本實驗利用電轉(zhuǎn)染法將含有人乳鐵蛋白基因的表達載體，導(dǎo)入到山羊乳腺上皮細胞和小鼠骨髓瘤細胞中，經(jīng)G418及PCR篩選獲得陽性細胞；轉(zhuǎn)染細胞增殖后經(jīng)催乳素誘導(dǎo)，培養(yǎng)液上清通過ELISA檢測證明，轉(zhuǎn)染細胞表達并分泌出入乳鐵蛋白。 利用細胞融合技術(shù)將未轉(zhuǎn)染人乳鐵蛋白基因的小鼠骨髓瘤細胞與表達人乳鐵蛋白的ICR小鼠的脾細胞進行融合，經(jīng)過HAT篩選獲得雜交瘤細胞株。細胞增殖后經(jīng)催乳素誘導(dǎo)，培養(yǎng)液上清通過ELISA檢測。同樣獲得了表達人乳鐵蛋

2、白的陽性雜交瘤細胞株。 1、BLG調(diào)控序列與人乳鐵蛋白功能基因構(gòu)建表達載體 表達載體的組成：山羊β-乳球蛋白基因調(diào)控序列，包括4.2kb的5'端和1.8kb的3'端，人乳鐵蛋白(hLF) cDNA，人巨細胞病毒(CMV)增強子序列及SV40polyA序列和新霉素抗性篩選基因(Neor)等基因元件 2、奶山羊乳腺上皮細胞系的建立 從泌乳奶山羊的乳腺實質(zhì)組織中分離得到原代乳腺上皮細胞，由于原代上皮細胞中含成纖

3、維樣細胞混合生長，所以傳代時本實驗采用分步胰酶消化反復(fù)貼壁法在DMEM/F12培養(yǎng)液中經(jīng)2～3次的選擇傳代可獲得純的乳腺上皮細胞系。 3、表達人乳鐵蛋白的奶山羊乳腺上皮細胞株和SP2/0細胞株的建立 通過電轉(zhuǎn)染法將含有Neor標記基因的BLC-14載體基因片段導(dǎo)入奶山羊乳腺上皮細胞、小鼠骨髓瘤細胞中，經(jīng)G418(400μg/ml)抗性篩選培養(yǎng)兩周左右，獲得59株抗G418的單克隆乳腺上皮細胞株和44株抗G418的單克隆小

4、鼠骨髓瘤陽性細胞株。對擴大培養(yǎng)的抗性細胞株進行催乳素誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)24h后的細胞上清液進行ELISA檢測，結(jié)果顯示有8株G418抗性乳腺上皮細胞株能夠表達重組人乳鐵蛋白，乳腺上皮細胞的平均表達水平是0.781μg/mL，以及12株表達人乳鐵蛋白的小鼠骨髓瘤的陽性細胞株，小鼠骨髓瘤細胞的平均表達水平是0.435μg/mL。 4、表達人乳鐵蛋白的雜交瘤陽性細胞株的建立 通過未轉(zhuǎn)染人乳鐵蛋白基因的小鼠骨髓瘤細胞與表達人乳鐵蛋白

5、的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞融合，經(jīng)過HAT篩選獲得54株整合有人乳鐵蛋白基因的雜交瘤細胞株。經(jīng)過蛋白質(zhì)表達檢測共有6株穩(wěn)定表達的陽性雜交瘤細胞株，陽性雜交瘤細胞株平均表達水平是0.653μg/mL。 結(jié)果表明，本實驗室所構(gòu)建的BLC14載體既能夠在山羊乳腺上皮細胞表達，同樣在非特異性宿主細胞—小鼠骨髓瘤細胞和雜交瘤細胞中也能夠表達的結(jié)果，可以推測出BLG調(diào)控序列與人乳鐵蛋白功能基因構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓瘤細胞后，可以對小鼠骨髓瘤細