華南地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學研究及N蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，它主要引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、弱仔、木乃伊及仔豬的呼吸道疾病，給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV基因組快速的變化以及免疫抑制特性，為PRRSV的防控帶來了巨大的困難。本試驗旨在對華南地區(qū)PRRSV的NSP2和ORF5基因變化及感染情況進行跟蹤調查，為了初步了解PRRSV的變異情況，對純化山的XF株與國內(nèi)外分離株進行基因序列比對;同時利用原核載體表達了ORF7基因，并純化該重組

2、蛋白免疫小白鼠制備單克隆抗體，為該病的分子流行情況及防治診斷提供參考。
　　1.華南地區(qū)PRRSV NSP2與ORF5基因的遺傳變異分析
　　為了了解華南地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行毒株遺傳變異及感染的情況，本實驗采用RT-PCR對分離到的14株PRRSV的NSP2和ORF5基因進行了擴增，采用CLUSTAL W軟件DNAstar軟件的MegAlign對測得序列進行序列比對和遺傳進化分析，結果發(fā)現(xiàn)NSP2和O

3、RF5核苷酸的同源性分別在83.3％-100％和95％-100％，而與國內(nèi)外分離到的毒株NSP2和核苷酸同源性分別在69.5％-99.3％和62.9％-99％，NSP2進化分析發(fā)現(xiàn)14株均為PRRSV均為美洲型毒株，并且和國內(nèi)流行毒株JXA1在同一分支上，表明華南地區(qū)流行的毒株仍為PRRSV變異株。
　　2.豬藍耳病病毒XF株的克隆純化及基因組測序分析
　　為了進一步研究最近華南地區(qū)流行的PRRSV毒株的特性，本試驗利用蝕斑

4、純化山XF毒株，并用primier5.0設計引物進行RT-PCR擴增各個目的片段并將其拼接，得到PRRSV XF株的全基因序列;然后將其與國內(nèi)外分離的毒株進行核苷酸序列對比分析。結果發(fā)現(xiàn)，其與國內(nèi)外分離株核苷酸及疫曲株同源性在60.3％-99.2％之間;其中與JXA1株相似性最高為99.2％，與EuroPRRSV相似性最低僅為60.3％，與三株廣東株的相似性在99.0％-99.1％之間，與RespPRRS MLV的相似性為89.4％，與

5、CH-la的相似性為94.9％。這表明XF株與JXA1株親緣關系最近，仍然為變異株。
　　3.PRRSV的N蛋白的原核表達以及單克隆抗體制備
　　本實驗室利用蝕斑純化山來的毒株成功克隆出N蛋白基因，并將其成功連接到pET-32α(+)上，并將其轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中誘導表達，可溶性分析表明原核表達的融合蛋白以可溶性形式存在，western-bloting檢測證明有良好的抗原性。利用Ni2+-NTA樹脂親和層析純