玻璃化冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和胚胎細(xì)胞骨架分布的影響.pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文玻璃化冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和胚胎細(xì)胞骨架分布的影響姓名：史文清申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)指導(dǎo)教師：朱士恩20060601A B S T R A C TC r y o p r e s e r v a t i o no f m a m m a l i a n o o e y t e si s b e c o m i n g a ni m p o r t a n tb i o t e

2、c h n o l o g yb e c a u s ei t i sc o n n e c tw i t ht h ed e v e l o p m e n to fa n i m a le m b r y ob i o t e c h n o l o g y ，p r e s e r v a t i o na n d u s e l l e S S o f g e n e t i cr e s o u r c e s ，a n dh

3、 u m a n a r t i f i c a la s s i s tt e c h n o l o g y ( A R T ) ．T op u m u et h e o p t i m a lc o n d i t i o nf o rt h ec r y o p r e s e r v a t i o no fp o r c i n eO O l 3 y t e s ，t h e e x p e r i m e n t sw e

4、 r e p e r f o r m e db yo b s e r v i n gt h eC P A s p e r m e a b i l i t yo fi nv i t r om a t u r a t i o no o c y t e sa t v a r i o u ss t a g e s ，m e m b r a n e i n t e g d t y , t h e e x p a n d o f c u m u l

5、 u s c e l l s i n v i t r i f i e d - w a r m e d c u m u l u s - O O C y t e sc o m p l e x e s ( c o c ) ，t h em o r p h o n o l o g yo fo o c y t e s c r y p r e s e r v e d w i t h d i f f e r e n t c o n t a i n e

6、r s ，a n d t h ed e v e l o p m e n to f a c t i v a t e d v i t r i f i e d - w a n n e d O O C y t e s ．N os i g n i f i c a n c ew a ss h o w ni n t h ev i a b i l i t yo fv i t r i f i e dO O C y c e sb y O P S m e t

7、 h o da t v a r i o u ss t a g e sb e t w e e n6 C P A su s e d ．H o w e v e r , t h e v i a b i l i t yo fv i t r i f i e dO O C y t e ss h o w e d s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e n t h eO O C y t e

8、 sa td i f f e r e n tm a t u r e s t a g e s ，a n dt h ev i a b i l i t yo f v i t r i f i e d - w a r m e do o c y t c sa t M Is t a g e w a ss i g n i f i c a n t h i g h e r t h a n t h a ta t M I I s t a g e ．T h ed

9、 e v e l o p m e n t a lp o t e n t i a l o fG V O O C ”@ Sv i t r i f i e db yO P Sm e t h o d w a ss i m i l a r t o t h a tb yC r y o l o o pm e t h o d ．T o a s s e s s t h e d e v e l o p m e n t a l p o t e n t i a

10、 l a f t e r t h e t r e a t m e n t s o ft o x i c i t ya n d v i t r i f i c a t i o n ，t h em e t h o d sw e r e a p p l i e d ，s u c ha sT B a n dF D A s t a i n i n g ，p a r t h e n o g e n e t i cd e v e l o p m e

11、n t a f t e re l e c t r i c a la c t i v a t i o n ，d i f f r e n e a l s t a i n i n g o fb l a s t o c y s t s ．T h e p a r a m e t e r s f o r e l e c t r i c a l a c t i v a t i o n i s d i f f e r e n tb e t w e e

12、n p r e s e n to f t h em o s t b l a s t o c y s t sa n do f t h et h eh i g h e s tq u a l i t y ．T h er e s u l t so f a s s e s s m e n to f T Ba n dF D A s t a i n i n gw e r ec o m p a r e d ．I tw a sa n a l y z e

13、dt h a t t h ed i s t r i b u t i o n so fs p i n d l e s ( m i c r o t u b u l e s ) ，m i c r o f i l a n a e n t s ，c h r o m o s o m e s ，a n dt h ec y t o s k e l e t o no f t h ei nv i v ob l a s t o c y s t sa f t

14、e r v i t r i f i c a t i o n ．T h ed a t as u g g e s tt h a t v i t r i f i c a t i o n i n d u c e d n e g a t i v ee f f e c to n t h ed e v e l o p m e n t a l c o m p e t e n c e T h et a x o lp r e t x e a t m e n

15、 tb e f o r ev i t r i f c a t i o no u l db e a l le f f i c i e n tm e t h o dt om i m p r o v e t h ed e v e l o p m e n t a lp o t e n t i a lo f v i t r i f i e d - w a r m e d o o c y t e sa si tr e d u c e st h ec

16、 r y o i n j u r y o f c h r o m o s o m e a n d s k e l e t o ns t r u c t u r e ．F u r t h e r r e s e a r c h e sw e r ee m p l o y e dt o f i n dw h a ta n dw h e r et h e c r y o i n j u r yw e r e i n t h ev i t r

17、i f e do o c y t @ s b yo b s e r v i n g t h e t h e d i s t r i b u t i o n o fm i t o c h o n d r i aa n d l i p i d d r o p l e t s ．T h eu l t r a s t r u c t u r ec h a n g e sa f t e rv i t r i f i c a t i o n w e

18、 r ef i n d e di n z o n ap e l l u c i d a ( Z P ) ，p e r i v i t e l l i n e s p a c e ( P V S ) ，c o n i c a lg r a n u l e ( C G ) ，m i t o c h o n d r i a ( M t ) ，l i p i dd r o p l e t ( L D ) a n d v e s i c l e

19、s ．1 1 1 e r e l a t i o no f v i t r i f i c a t i o nw i t ht h er a t e so f a p o p t o s o sw a s s e a r c h e d ．1 1 1 er e s u l t so f T U N E L s t a i n i n gs h o w e dt h a tt h eo s m o t i cp r e s s u r e

20、o fv i t r i f i c a t i o ns o l u t i o n s a n d d i l u t i o n s o l u t i o n s ，a n d t h et o x i c i t y c o u l d n o t e n h a n c et h e p e r c e n t a g e o fa p o p t o s i s ，H o w e v e q t h ev i t r i

21、f i c a t i o na n d w a r m i n g p r o c e d u r es i g n i f i c a n t l yi n d u c e dt h ea p o p t o s i s ，a n dt h e d e a t h o fo o c y t e s a f t e r v i t r i f i c a t i o n m a ym a i n l y r e s u l t f r

22、 o m t h e a p o p t o s i s t r i g g e r e db y t h ev i t r i f i c a t i o n i t s e l ￡O nt h ew h o l e ．山ee o n c l u t i o n sw e r es u n u n a r i z e dt h a t v i t r i f t c a t i o nh a v en e g a t i v e e

23、f f e c to nt h ed e v e l o p m e n m lc o m p e t e n c e o f p o r c i n eo o c y t e s ．T h ec r y o i n j u r i e sn o t o n l yd a m a g e t h eo r g n i a z t i o no ft h ec y t o s k e l e t o ni np o r c i n eO

24、O O y t e s ，b a ta l s ot r i g g e rt h ea p o p t o s i so f o o c y t e s ，c h a n g et h ec y t o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f m i t o c h o n d r i aa n d l i p i dd r o p l e t ．T h ev i a b i l i

25、 t yo f v i t r i f i e dp o r c i n eo o c y t e sc o u l db es i g n i f i c a n t l yi m p r o v e d b y t h ep r e t r e a t m e n to f T a x o l ，b u tn o t b yt h ec h a n g e o f v i t r i f i c a t i o ns o l u t