巨型艾美球蟲免疫原性相異株間消減cDNA文庫的構建及其差異表達基因分析.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由數(shù)種艾美球蟲(Eimeria)寄生在雞腸道黏膜細胞內(nèi)引起的一種寄生性原蟲病。在雞的各類疾病中，球蟲病發(fā)病率最高，是養(yǎng)禽業(yè)危害最嚴重的禽病之一。目前，雞球蟲病的防治仍然以藥物預防為主，但隨著耐藥蟲株的廣泛出現(xiàn)，藥物預防的效果越來越差，而且藥物的長期使用會殘留肉蛋，污染環(huán)境，影響人體健康，故球蟲病的防治趨勢由藥物轉(zhuǎn)向了免疫預防。巨型艾美球蟲(Eimeria.maxima)是在田間最常見的3種球蟲之一，具

2、有最強的免疫原性和一定的交叉免疫保護力，故在球蟲疫苗中，E.maxima是不可缺少的蟲種之一，但E.maxima在不同株間抗原變異最顯著，有時可因疫苗株與田間株間的抗原差異而導致免疫效果不佳，甚至失敗。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，巨型艾美球蟲上海株(SH strain)和南通株(NT strain)在免疫原性方面存在著顯著的差異，即上海株僅對同源株攻擊產(chǎn)生免疫保護力，而南通株對同源株與異源株攻擊均能產(chǎn)生免疫保護力。為了探索這兩株球蟲在免疫原性

3、上差異的分子基礎，本文開展了下列研究工作。
　　 1 E.maxima SH株和NT株未孢子化卵囊階段消減cDNA文庫的構建
　　 用常規(guī)方法分別從E.maxhna SH株和NT株未孢子化卵囊中提取總RNA，并用纖維素柱純化得到mRNA。在分別用球蟲的mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別以SH株cDNA為試驗組(tester)，NT株cDNA為驅(qū)動組(driver)，或相反以NT株cDNA為tester，SH株c

4、DNA為驅(qū)動組driver，經(jīng)過兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR后，將PCR產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)過藍白斑篩選，分別構建了2個抑制性消減文庫。隨機從兩個消減文庫中挑取陽性克隆，用接頭引物nest primer1和nest primer2R進行PCR擴增，經(jīng)PCR鑒定顯示E.maxima SH株和E.maxima NT株未孢子化卵囊消減cDNA文庫的重組率分別為95％(284/300)和8

5、9％(231/261)，差異基因片段大小分布在0.25 kb～1.0 kb之間。
　　 2 E.maxima SH株和NT株未孢子化卵囊階段消減cDNA文庫中差異表達基因的篩選與分析
　　 首先，用地高辛標記方法制備了4種探針，即SH株消減組cDNA探針、SH株未消減組cDNA探針和NT株消減組cDNA探針、NT株未消減組cDNA探針。隨后，分別用同源株消減組探針和異源株未消減組探針對同一克隆進行檢測，篩選差異表達克隆。

6、在被檢測的515個克隆(SH株284個，NT株231個)中，共獲得86個差異表達克隆，其中SH株63個，NT株23個。對差異表達克隆測序和同源性比對，共獲得10個重疊群(Contigs)，其中SH株6個，NT株4個。通過BLAST分析，SH株的6個contigs中5個見有同源序列，1個未見同源序列，可能為新基因；NT株的4個contigs中3個見有同源序列，1個未見同源序列，可能為新基因。最后，選取6個差異表達基因，根據(jù)其序列分別設計引