太湖土著藻毒素降解菌S11的降解特性與固定化研究.pdf

1、太湖流域位于我國(guó)長(zhǎng)江中下游，地處我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展最為發(fā)達(dá)的長(zhǎng)江三角洲，是上海、蘇州、無(wú)錫、常州等中國(guó)最高人口密度城市的主要飲用水水源。近年來(lái)，隨著大量工農(nóng)業(yè)和生活污水排入太湖，導(dǎo)致湖泊富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，有毒藍(lán)藻水華(HCBs)頻繁爆發(fā)，對(duì)湖泊生態(tài)環(huán)境和周圍居民的生活帶來(lái)很大影響。而藍(lán)藻水華產(chǎn)生的藻毒素，更嚴(yán)重威脅到人類健康。研究顯示，土著藻毒素降解菌去除藻毒素具有成本低、效率高、相對(duì)安全和利于生態(tài)修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。本論文從太湖成功

2、分離篩選鑒定出太湖土著藻毒素降解菌S11，對(duì)其藻毒素降解能力、降解效果和降解機(jī)制展開了系統(tǒng)研究，并構(gòu)建了藻毒素降解菌-人工介質(zhì)復(fù)合體技術(shù)對(duì)其進(jìn)行固定化研究。為藻毒素降解菌應(yīng)用于藻毒素去除和水環(huán)境修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　一，太湖土著藻毒素降解菌S11的分離、篩選與鑒定
　　以購(gòu)買藻粉為原料，采用組織研磨超聲破碎，70％甲醇萃取，等電子點(diǎn)去除藻膽蛋白等步驟，構(gòu)建藻毒素粗提物制備方法;采用高效液相色譜法，構(gòu)建藻毒素檢測(cè)方

3、法。從太湖水域宜興市周鐵鎮(zhèn)符瀆港藍(lán)藻堆積點(diǎn)采取樣品，對(duì)其進(jìn)行馴化培養(yǎng)、分離純化得到藻毒素降解菌，采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，藻粉提取法是快速、高效、可行的藻毒素粗提物提取方法，14 g藻粉約獲得2000μg MC-LR;采用高效液相色譜法測(cè)量藻毒素含量，對(duì)藻毒素檢測(cè)的濃度范圍為0.1-10.0μg/mL，建立的MC-LR和MC-RR的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:y=45.236x-5.465(R2=0.9991)，y=60.818x+

4、0.7245(R2=0.9990);從宜興市周鐵鎮(zhèn)符瀆港采集樣本，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻堆積點(diǎn)菌群對(duì)藻毒素具有藻毒素降解能力，經(jīng)馴化培養(yǎng)、分離、純化得到1株太湖土著高效藻毒素降解菌菌株S11，菌株單菌落呈圓形，邊緣整齊，顏色為白色，表面光滑，不粘稠，易挑取，革蘭氏陰性;對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，表明該菌屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。
　　二，太湖土著藻毒素降解菌S11的降解特性及機(jī)制研究

5、　　以篩選分離純化到得到的太湖土著藻毒素降解菌S11為研究對(duì)象，接種至以藻毒素為主要（或唯一）碳源氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，描繪了生長(zhǎng)曲線，分別研究其對(duì)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品、藻毒素粗提物中藻毒素和太湖水樣中藻毒素的降解能力，繪制降解曲線，評(píng)價(jià)降解效率;并通過(guò)對(duì)持續(xù)馴化6個(gè)月、冷凍保存6個(gè)月和停止馴化后傳代9次后S11的降解能力研究，探索菌株S11降解能力穩(wěn)定性;分別采用不同的溫度(20℃、30℃、37℃）、pH值(6、7、8)、藻毒素初始濃度（MC

6、-RR濃度37.13 mg/L、18.57 mg/L、9.08 mg/L和MC-LR濃度18.48 mg/L、9.56 mg/L、4.82 mg/L）和菌株接種量(5％、10％、20％)對(duì)菌株S11進(jìn)行藻毒素降解實(shí)驗(yàn)，研究其影響因素。設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR擴(kuò)增獲得藻毒素降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因mlrA，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序;利用高效液相色譜、高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜連用分析菌株S11作用后的藻毒素MC-LR中間產(chǎn)物，從而探討藻毒素降解菌S

7、11可能的降解途徑。結(jié)果顯示，在含藻毒素粗提物的MSM培養(yǎng)基、含MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品的MSM培養(yǎng)基和太湖藍(lán)藻堆積點(diǎn)水樣中，菌株S11均能良好生長(zhǎng)，并能將MC-RR和MC-LR降解至檢出限以下，平均降解速率可高達(dá)5.68 mg/(L·d)和3.08 mg/(L·d);菌株S11的藻毒素降解能力在長(zhǎng)期冷凍保存后和停止馴化3～6代之間可能會(huì)消失，但保存持續(xù)馴化或者停止馴化3代內(nèi)，能夠保持很好的藻毒素降解能力;菌株S11能夠在20℃到37℃溫度范圍

8、內(nèi)有效降解藻毒素MC-RR和MC-LR，降解速率隨溫度升而增加，能夠在pH值范圍6～8內(nèi)完全降解藻毒素MC-RR和MC-LR，最適酸堿環(huán)境為弱酸性和中性;菌株S11最適降解條件為30℃，pH=7，接種量10％;菌株S11對(duì)藻毒素的降解存在停滯期，并隨降解底物中藻毒素濃度的增加而延長(zhǎng)，在對(duì)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品為唯一碳源氮源的培養(yǎng)環(huán)境中，停滯期消失。菌株S11含有藻毒素降解關(guān)鍵酶基因mlrA的同源基因，并能在降解中間產(chǎn)物中檢測(cè)到四肽(m/z615.

9、3390)和Adda(m/z332.2208)離子碎片，其降解途徑與部分文獻(xiàn)報(bào)道的降解途徑一致。
　　三，太湖土著藻毒素降解菌S11的固定化研究
　　利用自行設(shè)計(jì)制作微生物-人工介質(zhì)復(fù)合體裝置，采用接種掛膜法將篩選分離得到的太湖土著高效藻毒素降解菌S11固定于人工介質(zhì)，形成藻毒素降解菌-人工介質(zhì)復(fù)合體;采用太湖藍(lán)藻為原料，配置含藻毒素的模擬廢水;分別監(jiān)測(cè)間歇運(yùn)行和持續(xù)運(yùn)行狀態(tài)下出水藻毒素濃度和出水COD、TP、TN等等指標(biāo)，

10、研究不同水力停留時(shí)間(HRT)對(duì)藻毒素去除效果和水質(zhì)的影響;采用停止運(yùn)行2、4月后再次運(yùn)行，探索該裝置對(duì)藻毒素降解的穩(wěn)定性;利用海藻酸鈉包埋篩選得到的太湖土著藻毒素降解菌S11，制得藻毒素降解菌包埋小體，評(píng)價(jià)包埋小體質(zhì)量，將其分別投入含藻毒素粗提物的MSM培養(yǎng)基和模擬廢水中，研究包埋小體對(duì)藻毒素的降解能力和重復(fù)利用情況。結(jié)果顯示，利用太湖新鮮藍(lán)藻為原料，成功配置出MC-LR濃度約為15μg/L的模擬廢水;利用組合介質(zhì)設(shè)計(jì)制作了藻毒素降解

11、菌-人工介質(zhì)固定化裝置，采用接種掛膜法成功將太湖土著藻毒素降解菌S11進(jìn)行固定;在間歇運(yùn)行下，裝置A、B都能有效降解MC-LR、COD和TP;裝置停止運(yùn)行2、4個(gè)月后進(jìn)行間歇運(yùn)行試驗(yàn)，仍可以完全降解MC-LR，具有較好的穩(wěn)定性;連續(xù)運(yùn)行下，水力停留時(shí)間（HRT）越長(zhǎng)，該裝置對(duì)MC-LR的降解作用越高，COD和TP降低越多;高曝氣量有利于MC-LR的降解;利用海藻酸鈉成功包埋太湖土著藻毒素降解菌S11，包埋小球成球容易，不易粘連，具有較好