表皮生長因子對體外長期孵育保存的人胎胰島的支持作用

1、<p>　　表皮生長因子對體外長期孵育保存的人胎胰島的支持作用</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 尿抑胃素 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on the proliferation and secretion of human embry

2、onic pancreatic islets in vitro. METHODS: Islets were isolated from pancreases of twelve human embryos and cultured in RPMI 1640 medium containing EGF (study group) or without EGF (control group). The percentage of isle

3、t beta cells was detected. The insulin content in the media, islet cells and islet beta cells insulin release were measured. RESULTS: By the end of cultu</p><p>　　【Keywords】 islets of langerhans;preservatio

4、n, biological;epidermal growth factorurogastrone </p><p>　　【摘 要】 目的： 研究表皮生長因子（EGF）對促進人胎胰島增殖與分泌功能.方法: 12個人胎胰島分別在含有EGF（實驗組）和不含有EGF（對照組）的培養(yǎng)基中孵育，觀察胰島B細胞的分布，測定培養(yǎng)基中和細胞內(nèi)胰島素濃度和胰島素釋放量.結(jié)果: 培養(yǎng)結(jié)束后實驗組胰島B細胞明顯高于對照組；培

5、養(yǎng)基和胰島B細胞中胰島素釋放量實驗組高于對照組.結(jié)論: 培養(yǎng)液中加入EGF能延長胰島細胞存活期、促進胰島細胞增殖和分泌功能. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】胰島；保存，生物學(xué)；表皮生長因子尿抑胃素 </p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　為了有足夠數(shù)量的健康胰島供給臨床移植使用，國內(nèi)外都在積極研究長期保存

6、胰島的方法［1,2］.經(jīng)典的深低溫保存方法，需要較貴重的設(shè)備，操作繁雜，復(fù)蘇后胰島的失活率＞30%；孵育保存的方法胰島難以長期存活，但只能維持1 mo，最多達5 mo［3］，胰島細胞的調(diào)亡在所難免.我們研究了表皮生長因子（epidermal growth factor）具有促進人胎胰島的增殖分泌作用.通過觀察胰島細胞的形態(tài)，測定細胞內(nèi)胰島素和胰島釋放量，以及胰島組織的存活期，探討更有意義的保存胰島的方法. </p><

7、;p>　　1 材料和方法 </p><p>　　1.1 材料 EGF購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液、人血清購自北京幫定醫(yī)藥公司.百級凈化實驗室內(nèi)，所有操作在潔凈工作臺進行. </p><p>　　1.2 方法 </p><p>　　1.2.1 人胎胰島的獲取 平均胎齡21周的人胎胰12例.經(jīng)4℃無

8、菌Hanks液漂洗，去除胰腺包膜、血管、胰管，剪為1 mm大小的碎塊，再次漂洗后置于培養(yǎng)瓶內(nèi). </p><p>　　1.2.2 孵育條件 RPMI1640培養(yǎng)液中加入80 mL&#12539;L-1同型人血清、丁胺卡那霉素100 u&#12539;mL-1；培養(yǎng)箱中37℃, 50 mL&#12539;L-1 CO2培養(yǎng)；隔日更換1/3培養(yǎng)液，共孵育14 d. </p

9、><p>　　1.2.3 分組 12個人胎胰島隨機分為實驗組和對照組.實驗組：表皮生長因子（EGF），100 ng&#12539;mL-1約1 mL加入上述孵育胰島14 d的培養(yǎng)瓶內(nèi)，共6瓶.每次更換培養(yǎng)液時均按此濃度加入EGF.對照組:未加EGF培養(yǎng)瓶做為對照組,共6瓶.更換培養(yǎng)液時也不加EGF. </p><p>　　1.2.4 觀察指標 免疫組織

10、化學(xué)的病理學(xué)觀察：不同孵育時限分別收集胰島細胞，100 mL&#12539;L-1甲醛固定，石醋切片，HE染色及胰島素和高糖素抗體酶標染色，觀察細胞有絲分裂相及胰島B細胞分布情況. </p><p>　　不同孵育時限時胰島功能指標的觀察：培養(yǎng)液中胰島素分泌量；胰島素釋放試驗（低糖和高糖加茶堿刺激）. </p><p>　　統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，采用方差分析進行

11、組間均數(shù)比較. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 酶標組織化學(xué)染色的組織學(xué)結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下隨機計數(shù)100個胰島的觀察均值,每個胰島中隨機計數(shù)10個胰島細胞中的組織學(xué)改變:有絲分裂細胞的比率、胰島素和胰高血糖素分泌顆粒的數(shù)目等.孵育30 d以內(nèi)，組間未觀察到明顯差異（P＞005）；3 mo時，對照組胰

12、島細胞內(nèi)已無胰島素和胰高血糖素的分泌顆粒，細胞核固縮或崩解；而ECF組的分泌顆粒至6 mo時仍不減少，9 mo時減少13.6%，細胞形態(tài)觀察無明顯變化.不同孵育時限的胰島中有絲分裂細胞情況見Tab 1. </p><p>　　表1 不同孵育時限對胰島中有絲分裂細胞比率的影響（略） </p><p>　　Tab 1 Effect of islets beta cells ra

13、te in different cultured time (略) </p><p>　　2.2 不同孵育時限的胰島功能指標觀察結(jié)果 見Tab 2.胰島素釋放試驗（低糖和高糖加茶堿刺激），與培養(yǎng)液中胰島素分泌量的變化同步，對照組3mo以后對釋放試驗無反應(yīng),而ECF組反應(yīng)敏感，并保持到9 mo以后. </p><p>　　表2 不同孵育時限時培養(yǎng)液中胰島素分泌量的改

14、變（略） </p><p>　　Tab 2 Change of serection in insulin culture media in different culture time （略） </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　近年來，胰島移植的研究集中在移植部位、移植途徑、抗排異反應(yīng)、和胰島

15、的保存等方面［4,5］.胰島移植的臨床應(yīng)用中每一受體均需要足夠量的成熟健康的胰島［6-8］，而一般胰島孵育保存的最佳時期在1 mo［3］.在此期間內(nèi)，培養(yǎng)液中胰腺小塊組織的外分泌組織和結(jié)締組織細胞逐步退化減少，而胰島組織能增殖和成熟［1，9］.但孵育1 mo后胰島細胞開始凋亡，其分泌功能下降.1 mo的短時期內(nèi)常不能積攢足夠的胰島，所以心須設(shè)法延長胰島的孵育保存時間. </p><p>　　表皮樣生長因子（EGF

16、）的Mr為6000左右，熱穩(wěn)定，是含有5個氨基酸殘基的多肽，存在于人和動物的尿液、乳汁和血漿中，對多種細胞是很強的促細胞分裂因子，能促進上皮細胞增殖、成熟、并保持活力［10-12］.但尚無EGF作用于胰島保存的報道.在本實驗中，胰島形態(tài)學(xué)檢查提示，含EGF培養(yǎng)液的孵育能刺激長期保存的胰島正常分泌胰島素和胰高血糖素；胰島細胞中有絲分裂相的變化提示ECF對長期保存的胰島細胞的增殖有顯著的促進作用.培養(yǎng)液中胰島素含量檢測和胰島素釋放試驗結(jié)果同

17、樣提示了上述結(jié)論. </p><p>　　在EGF作用下，孵育9 mo的胰島仍保持較好對高糖、茶堿刺激的敏銳反應(yīng)性.在胰島細胞培養(yǎng)液中加入,可延長胰島細胞存活期至10 mo以上，并促進細胞增殖，使胰島細胞分泌旺盛.本研究為臨床移植提供足量的健康胰島奠定可靠基礎(chǔ). </p><p><b>　　【參考文獻】 </b></p><p>　　［1］

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