兔骨髓間充質干細胞向胰島細胞分化的研究.pdf

1、骨髓間充質干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一類具有多向分化潛能的干細胞，有望成為未來細胞、基因治療、組織工程技術的理想種子細胞。本研究目的在于分離純化兔BMSCs，并研究其在體外分化為胰島細胞的潛能，以便未來利用該類細胞作為疾病細胞和基因治療的模型。為此，本試驗利用一月齡新西蘭大白兔為研究對象，較為系統(tǒng)全面地研究了其BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴增、鑒定、形態(tài)學及體外誘導分化能力，為進一步

2、深入研究BMSCs的誘導分化和應用打下試驗基礎。
　　 1.應用全骨髓法分離BMSCs，根據骨BMSCs在培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特點，通過傳代培養(yǎng)來純化已分離到的BMSCs，體外培養(yǎng)至第3代，獲得純度較高的BMSCs；對分離純化的第3代兔BMSCs進行形態(tài)學觀察和細胞表面特異性標志物鑒定，得出兔BMSCs表面標志CD90、CD44陽性表達，CD34陰性，進一步證實了本法所得到的純化細胞即為兔BMSCs，為進一步的試驗研究奠定基礎。結

3、論：全骨髓法能夠成功分離得到純度較高的兔BMSCs。
　　 2.采用二甲基亞砜聯合高濃度葡萄糖對分離純化的第3代兔BMSCs進行體外誘導，觀察誘導前后細胞形態(tài)學變化，結果試驗組在誘導7d出現細胞團樣集落，10d獲得排列緊密的細胞團，而對照組細胞始終未見細胞團；用雙硫腙染色法鑒定細胞團，結果顯示，試驗組為陽性；用免疫細胞化學法檢測細胞內胰島素的表達，試驗組顯示陽性；用ELISA法檢測分泌到培養(yǎng)液中的胰島素含量，結果顯示，試驗組7d

4、、10d的胰島素含量分別為(27.82±0.43)mU/L、(27.89±0.25)mU/L，與對照組的(23.39±0.20)mU/L、(25.71±0.27)mU/L比較，差異極顯著(P<0.01)。結論：二甲基亞砜聯合高濃度葡萄糖能夠在較短的周期內誘導出胰島細胞。
　　 3.采用含有10ng/mLbFGF、10ng/mLEGF、2％B27的DMEM/F-12培養(yǎng)液對BMSCs誘導6d，用含10ng/mLHGF、10ng/m

5、LBTC、10ng/mL活化素A、10mmol/L尼克酰胺、2％B27的H-DMEM培養(yǎng)液對BMSCs誘導6d，結果試驗組BMSCs細胞收縮并相互聚集成圓型細胞團，對照組未見細胞團；經雙硫腙染色，試驗組顯示陽性，顯示試驗組細胞具備胰島細胞富含鋅離子的典型特征；經免疫細胞化學染色，試驗組結果為陽性，顯示誘導后的BMSCs具備分泌胰島素的能力。結果顯示經本方法所誘導出細胞團細胞為胰島細胞。結論：應用細胞生長因子聯合作用能夠誘導BMSCs分化

6、為胰島細胞。
　　 4.將分離純化的BNSCs分為7組，分別標記為a、b、c、d、e、f、g組，其中a組為對照組，自始至終用含10％FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；b組先用無血清、含1％DMSO的DMEM/F-12誘導3d，再用H-DMEM培養(yǎng)基進行刺激培養(yǎng)；c、d、e、f組在b組的基礎上分別在第1、3、7、10d加入10mmol/L的尼克酰胺；g組用只含10mmol幾尼克酰胺的DMEM/V-12培養(yǎng)基進行誘導。誘導后