豬鏈球菌2型fbps基因突變株的構(gòu)建及其生物學特性的研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是導致豬鏈球菌病主要的病原菌。該菌可分為33個血清型，其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type2，SS2)致病性強、流行最廣泛并且在臨床上，該型是分離率最高的血清型之一。SS2可引起豬的腦膜炎、化膿性肺炎和心肌炎等疾病。SS2可通過直接感染特定從業(yè)相關(guān)人群，嚴重的病例發(fā)生中毒性休克綜合癥，導致多臟器衰竭及死亡，是一種重要的人畜共患病。近幾年豬鏈球菌病的

2、幾次爆發(fā)流行，因此SS2成為了國內(nèi)外廣泛關(guān)注和研究的熱點，尤其是關(guān)于其致病和免疫防治。
　　 SS2對宿主的粘附過程可能是其致病過程中一個關(guān)鍵的步驟。SS2和宿主細胞的粘附并非一個簡單的過程，在細菌和細胞表面都有多種相關(guān)因子參與了此過程，因此研究在此過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子可能會對SS2致病機理闡釋發(fā)揮重要作用。
　　 豬鏈球菌2型基因組中的fbps基因編碼了一種具有纖連蛋白結(jié)合位點的表面膜蛋白(fibronectin

3、binding proteins，F(xiàn)BPS)，和它具有同源性的同樣具有Fn結(jié)合活性的蛋白在其他鏈球菌的感染中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，因此推斷，F(xiàn)BPS可能是豬鏈球菌感染的吸附過程中的一個重要的參與蛋白。
　　 在此背景之下，我們以SS2高致病性菌株SC19作為親本菌株，以纖連蛋白結(jié)合蛋白編碼基因作為研究對象，構(gòu)建了fbps基因的缺失突變株，并在此基礎上分析fbps基因的缺失對SS2基本生物學性狀以及對致病力的影響，主要研究內(nèi)容包括：<

4、br>　　 1溫敏型自殺性重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 以2005年四川分離的SS2高致病性菌株SC19為親本菌株，分別擴增fbps基因的780bp上游序列和81bp的下游序列，并利用融合PCR的方法獲得上下游同源臂全長片段并連接到pMDx-18T載體，構(gòu)建克隆載體pMDx-18T-f，分別用EcoR1和BamH1同時酶切pMDx-18T-f和pSET4s載體后連接，構(gòu)建自殺性重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSET4s-fbps。
　　 2纖連

5、蛋白結(jié)合蛋白fbps基因突變株的構(gòu)建
　　 將重組質(zhì)粒pSET4s-fbps電轉(zhuǎn)化親本菌株SC19感受態(tài)細胞，以壯觀霉素抗性標記和溫度敏感雙重篩選，得到fbps基因缺失突變菌株。并進一步通過PCR等方式對篩選出的突變菌株進行驗證。
　　 3纖連蛋白結(jié)合蛋白fbps基因突變株生物學性狀的研究
　　 在構(gòu)建的fbps基因突變株的基礎上，研究缺失菌株的遺傳穩(wěn)定性，體外生長和增殖的能力等生物學性狀。結(jié)果表明，連續(xù)傳代十代

6、突變株均能穩(wěn)定遺傳。野生株和突變株的生長沒有顯著的差異，fbps基因的缺失不會影響SS2的生長和繁殖的速度。
　　 4 fbps對宿主的吸附侵入以及毒性作用
　　 以Hep-2細胞為模型，對比研究fbps缺失菌株和SC19野生型菌株粘附能力和侵入能力，以培養(yǎng)液中LDH的滲出為參照，測定培養(yǎng)液中LDH含量，比較突變株和野生菌株對細胞毒性作用。結(jié)果表明，fbps基因缺失突變株對Hep-2細胞的粘附能力和親本株SC19相比下降

7、了78%；對細胞侵入能力下降23%；測定LDH的濃度發(fā)現(xiàn)fbps基因突變株比野生型的毒性降低了32%。
　　 5突變株致病性研究
　　 將野生型菌株SC19和fbps基因缺失突變株分別以107cfu/ml，108cfu/ml和109cfu/ml的劑量腹腔注射昆明鼠(1ml)。結(jié)果顯示，注射突變株的死亡率遠遠低于注射野生型SC19菌株的試驗組。不同時間點剖殺小鼠不同器官的細菌動態(tài)分布表明，缺失了fbps基因?qū)е录毦慕M織定