哺乳動物基因工程

1、四、高等哺乳動物的基因轉移,第十六章 哺乳動物基因工程,三、高等哺乳動物的載體系統,二、高等哺乳動物的受體系統,一、高等哺乳動物基因工程的基本概念,,五、利用哺乳動物工程細胞生產重組蛋白,一、 高等哺乳動物基因工程的基本概念,第六節(jié) 哺乳動物基因工程,高等哺乳動物基因工程,高等哺乳動物細胞基因表達技術,高等哺乳動物轉基因技術,,,轉基因動物個體,動物工程細胞,,,哺乳動物遺傳性狀改良,藥物篩選研究評價模型,人體基因治療,蛋白

2、多肽物質大規(guī)模生產,藥物篩選研究評價模型,二、 高等哺乳動物的受體系統,1、高等哺乳動物細胞的生長特性2、高等哺乳動物受體細胞的條件3、高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記4、常用的高等哺乳動物受體細胞,,第十六章 哺乳動物基因工程,1、高等哺乳動物細胞的生長特性,正常的哺乳類動物細胞具有下列四大生物學特征：,錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂,血清依賴性：細胞必須具有生長因子才能生長,接觸抑制性：細胞與細胞接觸后

3、，生長便受到抑制,形態(tài)依賴性：細胞稱扁平狀，并有長纖維網狀結構,,,,,上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代,且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞,會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀,態(tài)稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。,2、高等哺乳動物受體細胞的條件,以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞應具備下列條件,細胞系特征 喪失細胞接觸抑制性和錨地依

4、賴性特征，便于大 規(guī)模培養(yǎng),遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存,合適的標記 便于轉化株的篩選和維持,生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制,,,,,大多數正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能,安全性能好 不合成分泌致病物質，不致癌,,滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。

5、,3、高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記,營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,,,,次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）,,,次黃嘌呤核苷（HR）,,GMP,,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）,,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途徑,嘧啶核苷酸生物合成途徑,次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶核苷激酶,,氨基喋呤（AP）,,氨基喋呤（AP）,,,從頭合成

6、途徑,補救合成途徑,3、高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記,營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細胞（tk -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細胞（hprt -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因hprt與

7、之遺傳互補,,,,3、高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記,哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記,,遺傳標記,編碼產物,篩選藥物,作用機理,,APH- 氨基糖苷磷酸轉移酶 G418 APH滅活G418,DHFR 二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤 DHFR變體抗氨甲喋呤,HPH- 潮霉素B磷酸轉移酶 潮霉素B HPH滅活潮霉素B,TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤

8、 TK合成TMP,XGPRT- 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP,ADA- 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA滅活Xyl-A,,4、常用的高等哺乳動物受體細胞,迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產,的高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（CHO），其優(yōu),勢有如下幾個方面：,遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定,與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確,

9、基因轉移和載體表達系統完善,耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng),被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞（GRAS）,,,,,,三、 高等哺乳動物的載體系統,,,,1、人腺病毒DNA,2、猴空泡病毒DNA（SV40）,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,,4、人牛痘病毒DNA,第十六章 哺乳動物基因工程,1、人腺病毒DNA,腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個,成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒

10、,腺病毒的生物學特性,有6個亞屬，其中常用來構建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型,（Ad5）病毒。,腺病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，,絕大多數的腺病毒成員均能致癌。,腺病毒的基因組DNA,,,,,,,,,,,,,,,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因組DNA全長36 kb，其包裝上限為原基因組的105%， DNA兩端各有,一個反向重復序列（IT

11、R）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復制及晚期基因的,表達調控有關，其中E3編碼晚期基因的調控因子， L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期,基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒,的成熟，不影響基因組的復制功能，因而在構建載體時往往除去這個2.2 kb的片段，,使得載體的裝載量提高到4 kb以上。,1、人腺病毒DNA,基因重排低 外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復制幾個周期,腺病毒DN

12、A載體的特點,安全性能好 不整合人的染色體DNA，不會導致惡性腫瘤,宿主范圍廣 對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格,使用效果好 外源基因在載體上容易高效表達,1、人腺病毒DNA,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、,VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNA,a. SV40的生物學特性,SV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、

13、H3、H4結合，從,而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結構。,SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，,便發(fā)生非同源整合而致癌。,b.SV40的基因組DNA,t / T基因編碼病毒的小抗原和大,抗原與病毒的致癌作用密切相關,SV40在裂解宿主細胞前的晚期,狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病,毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效,表達外源蛋白,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,c.SV

14、40 DNA-質粒DNA雜合載體的構建,重組的SV40 DNA分子必須經過,包裝后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。為了盡量提,高SV40的裝載量，必須刪除一些基因,片段，因此重組的SV40分子必須與野,生型病毒共感染受體細胞，才能形成,有感染力的重組病毒顆粒。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,,,,,pBR322,pBR322,

15、,,SV40,pV2-GPT是一種SV40 DNA與大腸桿菌質粒DNA雜合的載體，其,中gpt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉氨酶基因，用于篩選重組子。該,載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表達有生物活性的兔b-珠蛋白.,d.利用SV40 DNA載體表達外源基因的程序,SV40 載體,病毒晚期基因啟動子,,篩選標記,ori,缺陷的SV40 輔助病毒,,去除細菌序列,插入外源基因,重組分子,,分離病毒DNA,,,,,轉化,,,,,,,,,,,,,

16、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,篩選,增殖,感染,3、猴多瘤病毒DNA（SV40）,基因表達好 外源基因能高效表達,SV40 DNA載體的特點,基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現象,宿主范圍窄 只能轉染猴細胞,裝載量較小,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因,組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，

17、獨立于染色體而自,a. 人乳多瘤病毒的生物學特性,主復制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,b. 人乳多瘤病毒表達載體的構建,BKV - E.coli 穿梭載體,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的,基因，并與大腸桿菌質粒拼接，構成,穿梭載體，它不能整合，同時也不能,形成成熟的病毒顆粒裂解受體細

18、胞。,安裝細胞色素P450 dioxin介導的增強,子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達。,SV40來源的啟動子控制Neor 標記基因，以G418篩選重組子。,以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。,4、人牛痘病毒DNA,人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185 kb，能在宿主細,胞質中自主復制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內，構建,a. 人牛痘病毒的生物學特性,出的重

19、組病毒具有感染力，而且一經轉染，外源基因即可在最鄰近的,病毒啟動子的控制下高效表達。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外,DNA重組很困難，因此通常采用體內重組的方式進行。,4、人牛痘病毒DNA,目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統是一種預先構建好的重組病毒,其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在,b.人牛痘病毒DNA表達載體的構建,外源基因導入受體細胞之前，先以上述的重組病毒感染細胞，使其大,量表達T7RNA聚合酶，然

20、后再將含有外源基因和T7啟動子的細菌型重,組質粒導入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體,DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達出重組蛋白。,人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。,4、人牛痘病毒DNA,c. 利用人牛痘病毒載體表達外源基因的程序,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,牛痘病毒啟動子,T7 RNA聚合酶基因,T7啟動子,外源基因,細

21、菌重組質粒,感染,轉化,培養(yǎng),收集,四、 高等哺乳動物的基因轉移,,,（一）哺乳動物細胞的物理轉化法,（二）哺乳動物細胞的病毒轉染法,（一）哺乳動物細胞的物理轉化法,利用物理方法轉化高等哺乳動物細胞的主要優(yōu)點是外源基因表達,盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達產物的分離純化減輕,了負擔。但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形式隨,機整合在染色體DNA上，導致受體細胞基因滅活、外源基因不表達。,（一）哺乳動物細胞的物理轉化

22、法,將待轉化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此,時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內；,此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結構，DNA便進入受,體細胞；,1.磷酸鈣共沉淀法,將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時,棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉化株。,如果在外源DNA中摻入少量的受體細胞內源性DNA可以提高轉化,效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉化腫瘤病毒DNA，可使正常細

23、胞轉化為,癌細胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機制的最早理解。,（一）哺乳動物細胞的物理轉化法,將待轉化的DNA溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉化儀的,樣品槽內，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產生細小的縫隙，此時,電擊轉化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如生長在,懸浮液中的淋巴細胞等。,2. 電擊轉化法,DNA片段便可不經過胞飲作用直接進入受體細胞。,（一）哺乳動物細胞的物理轉化法,將待轉化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者

24、在表面,活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質體結構。,合，DNA隨即進入胞質和核內。,利用上述程序曾將外源基因成功地導入了小鼠的淋巴細胞和HeLa,3. 脂質體介導法,將這種脂質體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜融,細胞。,（一）哺乳動物細胞的物理轉化法,通過激素療法使雌鼠超數排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌,鼠，從其輸卵管內取出受精卵；,性原核內。,上述程序多用于動物個體的轉基因過程，由于必須單細胞逐一操,4. 顯微注射

25、法,借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄,作，所以不太適用于基因的克隆和表達。,（一）哺乳動物細胞的物理轉化法,血影細胞是指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導、低滲環(huán),境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細胞膜包裹的細胞,同時，外源DNA也容易進入。當上述外界條件消失后，紅細胞膜又可,恢復原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉入血影細胞，然后再將,5.血影細胞介導法,核結構。在溶血過程中，紅細胞膜的通透性

26、大增，在血紅蛋白溢出的,血影細胞與受體細胞在適當條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉入受,體細胞。,（二）哺乳動物細胞的病毒轉染法,以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉染或與野生型病毒顆粒,共轉染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、實驗重復性佳、導,入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍,有限，往往無法轉染一些具有重要經濟價值的家禽和牲畜細胞等。,五、 利用哺乳動物工程細胞生產重組蛋白,,,1.哺乳動物細胞高效

27、表達外源蛋白的基本原理,2.利用哺乳動物工程細胞生產人源化的小鼠抗體,3. 利用哺乳動物工程細胞生產人組織型纖溶酶原激活劑,,4. 利用哺乳動物工程細胞生產人凝血因子VIII,,哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理,基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內高效穩(wěn)定表達的一種特殊,方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細胞中的關鍵代謝酶二氫葉酸還原酶,數細胞死亡，但在極少數幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴,增。這些抗性細胞正是通過增加相關基

28、因的拷貝數、提高關鍵代謝酶,通過強化基因擴增高效表達外源基因,（DHFR）的特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經氨甲喋呤處理后，絕大多,的表達水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應。更重要的是，擴增的區(qū),哺乳動物細胞內的基因擴增現象,域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。,哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理,通過強化基因擴增高效表達外源基因,DHFR-MTX高效表達系統,,,,,,,,,,,,,,,,外源基因,dh

29、fr,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,轉染dhfr -細胞系,單克隆,培養(yǎng),轉移,0.05 mM MTX,培養(yǎng),單克隆,轉移,培養(yǎng),單克隆,轉移,5 mM MTX,0.25 mM MTX,,培養(yǎng),單克隆,外源基因擴增至100拷貝,,哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理,通過強化基因擴增高效表

30、達外源基因,GS-MSX高效表達系統,谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對動物細,胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉入培養(yǎng)的哺乳動物細,中不必使用GS缺陷型的受體細胞，而且在正常的MSX濃度下就能篩,選到含有高拷貝外源基因的轉染細胞，這是GS-MSX系統比DHFR-,胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉染過程,MTX系統優(yōu)越之處。,哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理,通過強化基因轉錄高效表

31、達外源基因,在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟,,,,,,mRNA前體,,,,AAAAAAAAA,mRNA,動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基,因高效表達的一種手段，如：,細胞巨化病毒CMV的啟動子,動物珠蛋白基因的內含子,SV40的終止子和polyA化信號序列,絕大多數哺乳動物細胞的表達型載體,上攜帶內含子結構，因為mRNA前體的剪,切能促進成熟mRNA向胞質的運輸，有利,于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。,哺乳動物細胞高效表達外源蛋

32、白的基本原理,利用哺乳動物工程細胞生產的重組蛋白,迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進行臨床試驗，但,在哺乳動物工程細胞中大規(guī)模生產的只有少數幾種：,b 干擾素g 干擾素,凝血因子VIII凝血因子IX,促紅細胞生成素（EPO）生長因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,單克隆抗體 CD4受體,組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,利用哺乳動物工程細胞生產人源化的小鼠抗體,大多數惡性淋巴

33、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Neor,鼠金屬硫蛋白啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體輕鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pL,,,,,,,,,,,,,,,,dhfr,SV40啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體重鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pH,,,,,,,,,,,,,,瘤細胞表面上都,有一種特異性的,糖蛋白campath,用人源化的小鼠,抗campath抗體,治療非霍金淋巴,細胞瘤患者，效,果良好。重組抗,體

34、采用DHFR-M,TX系統表達。,利用哺乳動物工程細胞生產人組織纖溶酶原激活劑,第一個由重組哺乳動物,dhfr,啟動子,人tPA cDNA,終止子,細胞規(guī)模化生產的醫(yī)用蛋白,是治療急性心肌梗塞的溶血,栓藥物：人組織纖溶酶原激,活劑（tPA）。同樣采用,DHFR-MTX系統表達，受體,細胞選用CHO系統。目前，,用該工藝路線生產的重組人tPA已經商品化。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,信號肽編碼序列,此外

35、，人tPA也可由重組大腸桿菌生產，但蛋白的重折疊效率低。,利用哺乳動物工程細胞生產人凝血因子VIII,凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關。多年來，血友病,病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進行治療，然,而由于人的血源污染乙肝病毒或愛滋病病毒，數千名使用這種血液制,品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛滋病而非血友病。,早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒,定，血源的污