色譜分析技術(shù)

1、第二篇 色譜分析技術(shù),一、色譜法的起源、發(fā)展及定義,概 述,一、色譜法的起源、發(fā)展及定義,柱色譜→薄層色譜和紙色譜→氣相色譜→毛細(xì)管柱色譜→高效液相色譜→薄層掃描儀→毛細(xì)管電泳→色譜-光譜聯(lián)用、多維色譜、智能色譜。,,液相色譜（經(jīng)典）,氣 質(zhì) 聯(lián) 用,又稱層析法，是一種依據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)（溶解性、極性、離子交換能力、分子大小等）的不同，當(dāng)流動相攜帶樣品流經(jīng)固定相時，樣品各組分在兩相中不斷的重新分配，最終達(dá)到分離與提純，以便于對樣品

2、進(jìn)行定性和定量分析的分析方法。,一、色譜法的起源、發(fā)展及定義,二、色譜法的分類,按兩相狀態(tài)不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過程的原理不同分類,,按兩相狀態(tài)不同分類,色譜其中的一相固定不動，稱為固定相; 另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。,兩 相狀 態(tài),,,流動相的物態(tài),液相色譜（LC）氣相色譜（GC）,二、色譜法的分類,按兩相狀態(tài)不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過程的原理不

3、同分類,,按操作方法不同分類,柱色譜,紙色譜,薄層色譜,二、色譜法的分類,按兩相狀態(tài)不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過程的原理不同分類,,按色譜分離過程的原理不同分類,（1）吸附色譜（2）分配色譜（3）離子交換色譜（4）分子排阻色譜（凝膠色譜法),三、色譜過程,四、色譜曲線相關(guān)術(shù)語,W：峰寬,Wh/2：半峰寬,tR：保留時間,t0：死時間,tR，：調(diào)整保留時間,,色譜峰,,基線,第七章 薄層色譜法,薄層色譜是在平面上進(jìn)行

4、分離的一種方法，又叫平面色譜法。通常將固定相(吸附劑)均勻地涂鋪在表面潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成薄板，進(jìn)行樣品分離。,特點：快速 靈敏（用量?。?高選擇性（如同分異構(gòu)體） 簡便 顯色方便 應(yīng)用廣泛：化合物的鑒別和少量化合物的分離 用于檢測藥品含量

5、 藥物合成中用于鑒別反應(yīng)程度和監(jiān)控反應(yīng)歷程 用于摸索高效液相的色譜條件,(一)吸附色譜分離原理利用吸附劑對不同成分吸附力的大小及展開劑解吸附作用的差異進(jìn)行分離。吸附牢的組分隨展開劑移動慢，吸附弱的組分隨展開劑移動快，一段時后，組分被分離。固定相:固體吸附劑流動相:液體展開劑,一、基本原理,第一節(jié) 薄層色譜法的基本原理,（

6、1）比移值Rf：,Rf是薄層色譜法基本定性參數(shù)，一定條件時Rf為定值，在0～1之間，可用范圍Rf值在0.2～0.8之間。組分極性越大，Rf越小,反之越大。,（二）比移值與相對比移值,（2）相對比移值Rs：為消除系統(tǒng)誤差,Rf<1,　Rs不一定小于1。,（二）比移值與相對比移值,二、吸附薄層色譜中吸附劑與展開劑,常用的吸附劑：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭和大孔吸附樹脂等。吸附劑的選擇要合適，與流動相、被分離化合物不反應(yīng),（一）吸附劑

7、（固定相）的選擇,（1）硅膠：極性吸附劑，應(yīng)用范圍廣 物理吸附為主，氫鍵吸附為輔 微酸性，不直接用于堿性成分的分離 機(jī)械強度好，適用于薄層色譜 吸附容量大，與羥基數(shù)目有關(guān)常用硅膠的規(guī)格：硅膠H，硅膠G，硅膠GF254等,（2）氧化鋁：a.極性吸附劑，較硅膠強。 b.物理吸附為主，氫鍵吸附為輔 c.

8、微堿性，不直接用于酸類成分的分離,堿性氧化鋁：適用于碳?xì)浠衔?、生?堿以及其它堿性化合物的分離。中性氧化鋁：應(yīng)用最廣，適用于醛、酮、 醌以及酯類化合物的分離。 酸性氧化鋁：適用于有機(jī)酸類的分離。,硅膠和氧化鋁含水量越高，吸附活性越弱。 只要在110℃左右加熱，這些“自由水” 就能被可逆性地除去。利用這一原理可以對吸附劑進(jìn)行活化（去水）和脫活化（加水）處理，以控制吸附

9、劑的活性。,硅膠、氧化鋁的含水量與活性級別,硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質(zhì)極性越大，越易被吸附。一般規(guī)律：（1）官能團(tuán)極性越大，整個分子極性越大，越易被吸附；（2）形成分子內(nèi)H鍵時，被吸附力減弱；（3）同系物中，分子量越大，極性越小，被吸附力越弱。常見官能團(tuán)極性順序： 烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<酯類<酮類 <醛類<硫醇<胺類<醇類<酚類

10、<羧酸類,被分離物質(zhì)極性與吸附能力的關(guān)系,（二）展開劑（流動相）的選擇,硅膠、氧化鋁薄層：展開劑的極性越大，其展開能力越強，化合物在色譜中移動的速度就越快，表現(xiàn)為Rf 增大。,常用溶劑極性大小,石油醚＜環(huán)已烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯 ＜乙醚＜三氯甲烷（氯仿）＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水,選擇原則：被分離成分極性大展開劑極性大被分離成分極性小展開劑極性小,吸附劑、展開劑選擇規(guī)律,考慮三方面因素：被分離組分極性，吸附劑活性

11、、洗脫劑極性。,活潑,不活潑,吸附劑（固定相）,展開劑（流動相）,被分離物質(zhì),B,B’,A,C,C’,極性,非極性,非極性,極性,,,,,,,,,A’,Ⅴ,Ⅰ,,,,,,,硅膠薄層色譜規(guī)律總結(jié),第二節(jié) 薄層色譜系統(tǒng)簡介第三節(jié) 操作方法及注意事項,略：在操作方法中部分介紹一、儀器的性能檢定二、背景干擾的消除三、樣品測定操作方法,1、薄層板的制備 2、點樣3、展開 4、顯色和定位5、薄層掃描儀對斑點

12、掃描,1、薄層板的制備,要求：玻璃板需光潔，否則吸附劑易脫落； 大小由需求決定。,薄層板分類和制法,軟板的制備硬板的制備 傾注法 平鋪法 機(jī)械涂布法,,,,1、薄層板的制備,（1）軟板的制備,軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑,3.橡皮膏 4.橡皮管,要求：厚度→隨分離要求而定，一般0.25～0.5mm 玻璃棒推動速度不宜過快、也不

13、應(yīng)停頓→影響厚度均一性優(yōu)點：方法簡便、隨用隨鋪、展開速度快。缺點：吸附劑易脫落、只能用近水平展開，效果差。,薄層板分類和制法,軟板的制備硬板的制備 傾注法 平鋪法 機(jī)械涂布法,,,,1、薄層板的制備,（2）硬板的制備,硬板：吸附劑加粘合劑制成的板,常用的粘合劑：煅石膏（Ｇ） 機(jī)械強度差，易脫落，但不易腐蝕　　　　　　　羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）

14、 機(jī)械強度好，不易脫落，但易腐蝕且,a、傾注法：硅膠G或氧化鋁G，直接加水調(diào)成糊狀硅膠或氧化鋁，加羧甲基纖維素鈉水溶液調(diào)成糊狀,,,倒在玻璃板上,,均勻鋪開、振蕩、晾干、活化、置干燥器中備用。,（2）硬板的制備,b、平鋪法：,1. 吸附劑薄層 2. 涂布器 3. 玻璃夾板4. 玻璃板 5. 玻璃夾板,過程：制板→振蕩→晾干→活化→備用優(yōu)點：一次鋪多塊薄層板，簡單易行。,（2）硬板的制備,c

15、、機(jī)械涂布法：,優(yōu)點：簡單方便、薄板厚度均勻、分離效果好。,手動涂布器 全自動涂布器,常用的薄層板：軟板：硅膠H板、氧化鋁H板硬板：常用的有硅膠G板、氧化鋁G板、硅膠CMC-Na板、氧化鋁CMC-Na板、硅膠GF 、硅膠GF,2、點樣,（1）樣品溶液的制備： 怎樣選擇溶劑？ 水可以用嗎？,2、點樣,（2）點樣量： 與薄層板的關(guān)系 太多太少的影響,點樣基線：距底邊2.0c

16、m樣點直徑：2-4mm點間距離：1.5-2.0cm,2、點樣,（3）點樣方法： 劃線、樣品記號點、點樣 注：動作要輕， 毛細(xì)管或點樣器不能混用， 斑點大小適當(dāng)，可多次點樣。,平頭50ul微量點樣器,全自動點樣儀,3、展開,展開缸（色譜缸）,3、展開,（1）展開方式：,a、近水平展開,特點：速度快、適用于軟板的展開。,3、展開,（1）展開方式：,b、上行展開,過程：預(yù)飽和（濾紙貼于展開槽

17、內(nèi)側(cè)）、展開、標(biāo)記溶劑前沿,c、單向二次展開d、雙向二次展開,3、展開,（1）展開方式：,3、展開,（2）注意事項：,a、色譜槽需密閉良好脂溶性展開劑：甘油淀粉糊水溶性展開劑：凡士林b、注意防止邊緣效應(yīng),4、顯色和定位,一般規(guī)律：日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法,紫外燈觀察,噴顯色劑觀察,5、薄層掃描儀對色譜斑點進(jìn)行掃描,用一束長寬可以調(diào)節(jié)的一定波長、一定強度的光照射到薄層斑點上進(jìn)行整個斑

18、點的掃描，用儀器測量通過斑點或被斑點反射的光束強度的變化從而達(dá)到定量的目的。,判斷依據(jù)：Rf值、Rs值,1、查找資料：影響Rf值的因素 吸附劑種類、活度、顆粒大??；展開劑純度和極性；薄層厚度；點樣量；展開方式、溫濕度；展開槽中的預(yù)飽和狀態(tài)等。2、對照品比較法：常用。,四、結(jié)果計算和判斷（一）定性鑒別,1、對照品比較法：,雜質(zhì)對照品制成一定濃度的溶液,樣品制成一定濃度溶液,,按相同的點樣量點樣,,,展開后觀察斑點顏色深淺和大小

19、,（二）雜質(zhì)檢查（雜質(zhì)限量檢查）,如異煙肼中游離肼的檢查： 肼是一種誘變劑和致癌物質(zhì)，中國藥典對異煙肼原料和注射用異煙肼中游離肼的檢查均采用薄層色譜法。 檢查方法　取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作為供試品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相當(dāng)于游離肼50μg）的溶液，作為對照溶液。吸取供試液10μl 與對照溶液2μl，分別點于同一硅膠薄層板（用羧甲基纖維素鈉溶液制備）上，以異丙醇－丙酮（3:

20、2）為展開劑，展開后，晾干，噴以乙醇制對二甲氨基苯甲醛試液，15min后檢視，在供試品主斑點前方與硫酸肼斑點相應(yīng)的位置上，不得顯黃色斑點。,2、自身稀釋對比法（雜質(zhì)結(jié)構(gòu)不明或無雜質(zhì)對照品）,樣品溶液稀釋制成一定濃度的溶液,樣品制成一定濃度溶液,,按相同的點樣量點樣,,,展開后觀察斑點顏色深淺和大小,（二）雜質(zhì)檢查（雜質(zhì)限量檢查）,如地西泮中有關(guān)物質(zhì)的檢查： 取本品的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于地西泮200mg），加丙酮5ml,振搖，使地西

21、泮溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液；精密量取適量，加丙酮稀釋成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作為對照溶液。點樣展開后，供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，與對照溶液的主斑點比較，不得更深。,1、目視比較法：,對照品制成不同濃度的系列溶液,樣品制成定量溶液,,按相同的點樣量點樣,,,展開后觀察斑點顏色深淺和大小,注：本法適用于近似含量的測定，誤差±10%,（三）含量測定,2、斑點洗脫法,對照品制成溶液 點于薄板兩側(cè),

22、樣品制成一定濃度溶液 線狀點于薄板起始線中間部分,,,展開,,,,,對對照品顯色，以此為依據(jù)刮下含有樣品的吸附劑,,,,,將樣品溶解，按照分光光度法測定溶液濃度,（三）含量測定,3、薄層掃描法,（三）含量測定,（1）外標(biāo)法 用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求

23、出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標(biāo)一點法定量。 此法要求點樣量準(zhǔn)確相同。,取本品水蜜丸6g，研碎，或取小蜜丸或大蜜丸9g，切碎，加硅藻土4g，研勻。加乙醚40ml，低溫回流1小時，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加丙酮1ml使溶解，作為供試品溶液。

24、另取丹皮酚對照品，加丙酮制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述兩種溶液各10μl,分別點于同一硅膠Ｇ薄層板上，以環(huán)己烷－醋酸乙酯(3:1) 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸性 5％三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)褐色斑點。 （2005年版《中國藥典》一部 401頁）,一、六味地黃丸中丹皮酚的薄層鑒別,第四節(jié) 應(yīng)用實例,1.丹

25、皮酚；2～5.六味地黃丸,六味地黃丸中牡丹皮的薄層圖譜,二、醋酸可的松中其他甾體的檢查,,取本品，加氯仿-甲醇(9︰1) 制成每1ml 中含10mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加氯仿-甲醇(9︰1) 稀釋成每1ml 中含0.10mg的溶液，作為對照溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅴ B）試驗，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一硅膠Ｇ薄層板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385︰6

26、0︰15︰2) 為展開劑，展開后，晾干，在105 ℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍(lán)試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于3 個，其顏色與對照溶液的主斑點比較，不得更深。,三、硫酸長春堿中雜質(zhì)的限量檢查,,《中國藥典》(2005年版)規(guī)定硫酸長春堿中其他生物堿的檢查方法如下：取本品，加甲醇制成10mg/ml溶液作為供試溶液。精密吸取適量加甲醇制成0.02mg/ml溶液作為對照液。取上述兩溶液各

27、5μl點于同一硅膠GF254薄板上，展開，檢識；供試溶液中的雜質(zhì)斑點不得超過兩個，且顏色不得深于對照溶液主斑點的顏色。,四、鹽酸氯丙嗪中有關(guān)物質(zhì)的限度檢查,,有關(guān)物質(zhì)（吩噻嗪類其他取代物） 避光操作。取本品，加甲酸制成每1ml中含10mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加甲醇稀釋成每1ml中含0.1mg的溶液，作為對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮-二乙胺（8