神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

1、1,Neurotrophic Factors,,2,,3,,一個(gè)漫長(zhǎng)卻精彩的故事~~~,4,,從前，人們不知道…… 在發(fā)育的過(guò)程中，一個(gè)神經(jīng)元怎樣找到它的靶組織,5,,直到，一個(gè)聰明的老頭兒，做了一個(gè)聰明的實(shí)驗(yàn)……,6,1934: Victor Hamburger discovered that removal of a limb bud resulted in reduced numbers of sensory and

2、 motor neurons in the spinal cord.,,7,Based on his limb-bud experiments, V. Hamburger hypothesized that the targets of innervating neurons provide signals that recruit undifferentiated cells to develop into sensory or mo

3、tor neurons.,(he was wrong),In 1942, Levi-Montalcini and Levi proposed that target derived signals maintain survival of differentiating neurons. In 1949, Hamburger and Levi-Montalcini repeated the limb bud experiments a

4、nd found that their results supported the neurotrophic hypothesis.Hamburger, V. and Levi-Montalcini, R. (1949) J. Exp. Zool. 111: 457-502.,8,Effect of Removing or Augmenting Neural Targets on the Survival of Related Ne

5、urons,PN23092.JPG,1949: Victor Hamburger showed that transplantation of a supernumerary limb resulted in increased numbers of sensory and motor neurons in the spinal cord.,9,神經(jīng)元與靶組織的勝利會(huì)師！,10,那么，為什么神經(jīng)元需要如此強(qiáng)得依賴自己的靶組織？,要滿足發(fā)

6、育中神經(jīng)系統(tǒng)與其服務(wù)的機(jī)體的比例所需的神經(jīng)元的數(shù)目要與其靶組織精確的匹配,一個(gè)普遍的，令人驚嘆的策略,11,如何實(shí)現(xiàn)？,脊髓中的這些神經(jīng)元，與其他的神經(jīng)元競(jìng)爭(zhēng)存在于其靶標(biāo)（肢芽）的某種資源，而這種資源是有限供應(yīng)的。 因此，成體神經(jīng)元的數(shù)目并非最初被強(qiáng)硬的遺傳決定的，而是可以在發(fā)育的個(gè)體中被特殊的神經(jīng)元-靶組織的相互作用而決定。,12,營(yíng)養(yǎng)作用的分子基礎(chǔ),關(guān)于神經(jīng)元及其靶標(biāo)的假說(shuō)：第一，最小劑量依賴。第二，靶源組織分泌。第三

7、，數(shù)量有限。,13,,14,15,NGF的簡(jiǎn)史,雞胚移植實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法的建立分離、純化、命名諾貝爾,16,1954: neurite outgrowth assay,– extract,+ extract,1969: NGF purified to homogeneity,Stanley Cohen,Rita Levi-Montalcini,1986: Levi-Montalcini and Cohen split the Nobe

8、l prize for Physiology or Medicine “for their discovery of growth factors”,1960: NGF purified,17,關(guān)于NGF遺留的問(wèn)題,生理環(huán)境下對(duì)神經(jīng)存活的重要作用 通過(guò)慢性注射N(xiāo)GF的抗血清來(lái)剝奪發(fā)育中的老鼠的NGF（knockdown）——導(dǎo)致成年小鼠失去大量NGF依賴的神經(jīng)元注射外源性NGF（overexpression）——?jiǎng)t可以引起膨大的交感

9、神經(jīng)節(jié)與NGF剝奪的現(xiàn)象正好相反。,18,,沒(méi)有直接證據(jù)顯示NGF是由其靶組織合成，或者說(shuō)神經(jīng)元從靶組織攝取。神經(jīng)組織中受體的存在？特別是，NGF的信號(hào)只在生長(zhǎng)的神經(jīng)元軸突接觸到其靶標(biāo)后才出現(xiàn),19,NGF summay,NGF可以介導(dǎo)兩類特殊的神經(jīng)細(xì)胞類群~交感神經(jīng)元和一些感覺(jué)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）相關(guān)神經(jīng)元在NGF剝奪的情況下會(huì)死亡；而更多的NGF則可以使更多的神經(jīng)元存活；存在于神經(jīng)元的靶組織；在相關(guān)的投射神經(jīng)元中存在NGF的受體。

10、 ~~~~~~~~神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的金標(biāo)準(zhǔn),20,NGF: sympathetic neurons and some sensory neurons,(CNS neurons do not require NGF for survival),BDNF: NGF-related factor purified in 1982 from pig brain (shares ~50%

11、 homolog with NGF),NT-3 and NT-4/5: were obtained by PCR cloning,All these factors are synthesized as ~250 aa precursors that are processed into 120 aa proteins,21,Neurotrophins BDNF (brain derived neurotrophic factor) o

12、n cortical neurons,22,23,24,NTF的分類,25,,這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示出，NGF可以本地作用于刺激突起末梢的生長(zhǎng)-但這一細(xì)胞的其他突起，沒(méi)有接觸到NGF的，則回縮。另外，生理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，NGF及其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素可以影響突觸的活性及可塑性，這一點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立于他們的細(xì)胞存活的作用。因此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的活性有很高的選擇性，依賴于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的類型、相應(yīng)神經(jīng)元分化的階段，以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)參與的細(xì)胞區(qū)域。,26,睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)

13、因子 (Ciliary neurotrophic factor，CNTF),1980年，Adler等由E8雞胚眼中分離到CNTF，分子量20kDa的酸性蛋白，由199aa組成，進(jìn)化上比較保守，與LIF、IL-6等構(gòu)成成血細(xì)胞因子(hematopoietic cytokine)超家族分子以單體形式存在，無(wú)糖基化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)富含α-螺旋結(jié)構(gòu)，為維持活性所必需CNTF缺少信號(hào)肽序列，在真核細(xì)胞中表達(dá)的CNTF不能分泌到胞外,27,

14、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF),1993年6月，美國(guó)Synergen生物技術(shù)公司的Lin等發(fā)現(xiàn)并克隆了一種新的NTF，由134個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為15kDaGDNF前體有19個(gè)AA的信號(hào)肽，成熟多肽鏈中有7個(gè)保守的半胱氨酸，活體形式為二聚體 其它GDNFs成員：NTN (neurturin)、PSP (persep

15、hin)、ART (artemin),28,非神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子肽類生長(zhǎng)因子,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)：aFGF、bFGF表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)：IGF-I，IGF-II白細(xì)胞介素(interleukin，IL)：IL-1，神經(jīng)白細(xì)胞素(neuroleuki

16、n),29,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),,30,,,31,32,,,33,Trk受體的分布,TrkA分布在交感、感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及基底前腦TrkB分布在整個(gè)NS中，在肺、肌肉也有少量表達(dá)TrkC主要在大腦皮質(zhì)，海馬，小腦表達(dá)；TrkC與NT-3在外周分布的不一致性,34,,35,Trk受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),PLC-IP3/DAGIP3-Ca2+/CaM： 可誘導(dǎo)LTP，促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)中樞突觸神經(jīng)遞質(zhì)的受體分

17、型DAG/Ca2+-PKC： 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43 (growth associated protein-43)是PKC的一個(gè)底物，它在成熟突觸中是神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)連接再生和突觸可塑性的一個(gè)決定因子,36,p75NTR structure,NGF KD=10-9M(all neurotrophinscan bind p75NTR),Roux and Barker (2002) Prog Neurobiol 67:

18、203-233,37,p75NTR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),胞外區(qū)： 4個(gè)重復(fù)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，與配體結(jié)合有關(guān) 胞內(nèi)： 無(wú)固定的配體誘導(dǎo)的酶激活域，含有6個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD),38,,,39,,40,Trk受體與p75受體的相互作用,Trk受體與p75受體共表達(dá)， p75受體增加配體與Trk的結(jié)合力，TrkA對(duì)p75NTR介導(dǎo)的信號(hào)通路具有抑制效應(yīng) p75N

19、TR介導(dǎo)的凋亡作用只有在細(xì)胞內(nèi)Trk的表達(dá)水平很低或不表達(dá)的情況時(shí)才會(huì)出現(xiàn),41,NT的主要生物學(xué)效應(yīng)☆,發(fā)育期：促進(jìn)神經(jīng)元的存活，生長(zhǎng)和分化成熟對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的選擇作用誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長(zhǎng)控制神經(jīng)元存活數(shù)量,42,NT的主要生物學(xué)效應(yīng),成年期：NT及其受體的表達(dá)和分布都明顯減少，效應(yīng)神經(jīng)元對(duì)NT的依賴也明顯降低維持部分神經(jīng)元的存活和正常功能神經(jīng)元可塑性 神經(jīng)損傷修復(fù),43,NT的主要生物學(xué)效應(yīng),非神經(jīng)系統(tǒng)：

20、 NT與其它肽類生長(zhǎng)因子一樣，也是多功能生長(zhǎng)因子，可影響免疫、造血、內(nèi)分泌、和生殖等系統(tǒng)的功能,44,CNTF的主要生物效應(yīng),對(duì)中樞和周?chē)\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用影響非神經(jīng)組織,45,,,46,GDNF的主要生物效應(yīng),對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)支持促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育、修復(fù)損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)支持,47,NTF的作用模式,逆行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（靶源性的）：經(jīng)典的NTF作用途徑；靶細(xì)胞合成NTF，經(jīng)軸突末端的受體介導(dǎo)，

21、逆行軸突轉(zhuǎn)運(yùn)到胞體,48,,49,NTF的作用模式,順行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：許多靶神經(jīng)元依賴于傳入投射維持其存活，上游神經(jīng)元通過(guò)大分子物質(zhì)的順行軸突轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)靶神經(jīng)元起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,50,NTF的作用模式,NTF的局部作用（旁分泌方式）：靶組織與其支配的神經(jīng)元共存于同一組織，來(lái)自靶合成的NTF作用于臨近效應(yīng)神經(jīng)元,51,NTF的作用模式,神經(jīng)鞘合成NTF： 發(fā)育期、神經(jīng)損傷期合成增加，成熟期降低；可在局部分泌為未建立神經(jīng)靶聯(lián)系的軸突提供營(yíng)

22、養(yǎng),52,NTF的作用模式,通過(guò)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)： 膠質(zhì)細(xì)胞本身就能釋放NTF；在某些生長(zhǎng)因子存在時(shí)可釋放NT完成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,53,NTF的作用模式,神經(jīng)元合成NTF： 通過(guò)順行軸突、逆行軸突轉(zhuǎn)運(yùn)以及局部作用的方式發(fā)揮作用,54,NTF的作用模式,自分泌作用： 神經(jīng)元，既合成NTF也有相應(yīng)受體表達(dá)，并對(duì)自身的NTF有反應(yīng)；不能介導(dǎo)神經(jīng)元與靶之間的相互作用，但可維持神經(jīng)元直到與靶之間建立突觸聯(lián)系,55,N

23、TF的作用模式,非分泌方式的NTF： CNTF，aFGF，bFGF缺少信號(hào)肽序列，不能分泌到胞外，細(xì)胞損傷時(shí)才能釋放，適應(yīng)神經(jīng)再生需要,56,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與疾病,,57,基因敲除動(dòng)物模型,58,NTFs及其受體基因敲除小鼠的表型,59,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的臨床應(yīng)用前景,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的選擇活性及臨床應(yīng)用可能,60,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的臨床應(yīng)用前景,帕金森病 (Parkinson disease，PD)： 主要病因：黑質(zhì)紋

24、狀體通路中的多巴胺能神 經(jīng)元的進(jìn)行性退化造成 治療：BDNF GDNF：對(duì)DA能神經(jīng)元作用最強(qiáng)的NTF,61,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的臨床應(yīng)用前景,肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化 (ALS) 主要原因：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的致死性病變。 治療：除NGF外的NT以及GDNF、CNTF、IGF 其中BDNF和IGF-1已開(kāi)始臨床試驗(yàn),62,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的臨床應(yīng)用前景,阿爾茨海默病(AD) 主要原因：膽堿

25、能神經(jīng)元的病變。 治療：多種NTF，維持膽堿能神經(jīng)元的存活，上調(diào)ChAT表達(dá),63,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的臨床應(yīng)用前景,外周感覺(jué)神經(jīng)病 主要原因：外周感覺(jué)神經(jīng)元的退化。 治療：NGF為主,64,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的臨床應(yīng)用前景,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素為蛋白質(zhì)，難以通過(guò)血腦屏障，故不能直接通過(guò)全身給藥治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 腦內(nèi)給藥 利用蛋白修飾增加穿過(guò)血腦屏障的能力 利用基因工程手段增加NTF的功能，擴(kuò)大應(yīng)用范圍 多種

26、NTF聯(lián)用 尋找調(diào)控NTF及其受體表達(dá)或啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子物質(zhì),65,遺留的問(wèn)題,找到靶組織以前，神經(jīng)元靠什么活著？在CNS中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元存活數(shù)目與NT的聯(lián)系敲除NT 或者Trk受體，可以發(fā)現(xiàn)引起可預(yù)測(cè)的PNS的缺陷，但對(duì)CNS的結(jié)構(gòu)和功能的影響非常小。,66,目前的研究,介導(dǎo)的信號(hào),,受體降解速率激活另外通路抑制了去磷酸化的過(guò)程,67,分泌方式的調(diào)控,68,,膜表面受體量的調(diào)控,69,受體內(nèi)吞后命運(yùn)的調(diào)控,70,7

27、1,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 284, NO. 22, pp. 15126–15136, May 29, 2009,72,,如果 ~~~ 你~~ 提純出了一種蛋白~~證明了它具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的特點(diǎn),73,你的選擇,A: 發(fā)了吧趕緊，發(fā)一個(gè)4-5分的B: 得到DNA序列，表達(dá)模式，發(fā)一個(gè)7-8分的C: 敲掉看看，做些功能，發(fā)個(gè)cellD: 找到受體，再發(fā)個(gè)cel

28、lE: Boss 決定,74,知道蛋白序列，怎樣找到DNA序列？,兼并引物，PCR表達(dá)文庫(kù)，用抗體釣基因組測(cè)序的數(shù)據(jù),怎樣找到受體,酵母雙雜交免疫共沉淀GST-pull downCO-IP 結(jié)合質(zhì)譜……,75,76,Concept of Neurotrophic Factor (NTF),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是機(jī)體產(chǎn)生的能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、分化的一類多肽或蛋白質(zhì)因子,它不僅在發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活, 而且能阻止成年神經(jīng)