微生物發(fā)酵制藥寶典第十章制藥微生物菌種建立

1、制藥工藝學(xué),,,主講教師：元英進 教授,天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系,Pharmaceutical Technology,第二篇 生物技術(shù)制藥工藝,第十章 微生物發(fā)酵制藥工藝,10.1 概述10.2 微生物生長與生產(chǎn)的關(guān)系10.3 制藥微生物菌種建立10.4 制藥微生物培養(yǎng)基制備10.5 滅菌工藝10.6 微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)10.7 發(fā)酵工藝過程的檢測與控制,10.3 制藥微菌種的建立,10.3.1 新藥生產(chǎn)菌種的選育

2、10.3.2 菌種保藏10.3.3 菌種庫建立與質(zhì)量控制,制藥生產(chǎn)對菌種的要求,1.遺傳穩(wěn)定性：能長期繁殖，不易變異和退化。純種，無雜菌及噬菌體。2.易生長性：生長旺盛、迅速；4.容易培養(yǎng)性：條件易控，利用價廉易得的原料。3.抗污染性：自身保護機制，抵抗雜菌污染能力強。4.經(jīng)濟性：發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高，良好經(jīng)濟能力。5.突變敏感性：對各種誘變較敏感，提高的潛力大。,菌種選育的目的：改善菌種的特性，使提高產(chǎn)量，改進質(zhì)量，降低成本

3、，改革工藝，方便管理及綜合利用,10.3.1.1 自然分離,目的：出發(fā)菌的獲取樣品的采集：大陸表層土壤，海洋水體預(yù)處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性。 溫度；化學(xué)處理；離心、膜過濾培養(yǎng)基：選擇性，營養(yǎng)和pH；添加抑制劑。分離方法： （1）稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖液 （2）濾膜法：細(xì)菌在膜上，放線菌進入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：溫度。放線菌：25－30℃，32－37℃，45－50℃；7－14天至1月

4、。,藥物的篩選,瓊脂擴散法——活性測定：非致病菌為對象，篩選生物活性物質(zhì)。耐藥和超敏菌種。HPLC、LC－MS等，分析鑒定活性物質(zhì)。靶向篩選高通量篩選高內(nèi)涵篩選,微生物藥物與菌種的篩選流程,樣品采集,微生物分離,培養(yǎng),篩選鑒定,,,,篩選方法學(xué)建立,陽性結(jié)果,,化合物分離純化鑒定,,前藥－新化合物,新藥研究與開發(fā),,菌種鑒定與保藏,,生產(chǎn)出發(fā)菌,,10.3.1.2 生產(chǎn)選育,概念：不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變而進行

5、的菌種篩選過程。應(yīng)用： （1）菌種的提純復(fù)壯。（2）防止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1年1次。過程,菌種,單孢子,單菌落測活,平板分離,優(yōu)良菌株,,,,,效率低（10－E5－E8），增產(chǎn)幅度小,10.3.1.3 誘變育種,概念：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個體，淘汰劣質(zhì)個體。,物理類：紫外線，快中子，激光，太空射線?；瘜W(xué)類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。生物類：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。,特點：快速，簡單，效益大。缺點：無

6、定向性，大量篩選。,誘變方案設(shè)計,出發(fā)菌種的選擇：較高產(chǎn)，對誘變劑敏感。誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中等劑量（80％致死率）。選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產(chǎn)物濃度。,誘變育種流程,出發(fā)菌種,單孢子懸液,稀釋涂板,單菌落初篩,高產(chǎn)菌株,誘變處理,穩(wěn)定性特性,放大中試,復(fù)篩,投入生產(chǎn),,,,,,,,,,10.3.1.4 原生質(zhì)體融合育種,概念通過化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個不同

7、種類的體細(xì)胞融合在一起，形成雜合細(xì)胞，產(chǎn)生兼具兩個親本遺傳性狀的新細(xì)胞。特點：有一定的定向性，效果顯著。,d.篩選，鑒定,e.高產(chǎn)菌株,,a. 原生質(zhì)體制備：用去壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生質(zhì)體。,操作過程,,概念：操作對象為單染色體組成的基因組，以原生質(zhì)體融合技術(shù)為基礎(chǔ)，使基因組整體發(fā)生重組形成候選突變庫，經(jīng)過篩選得到生產(chǎn)途徑和表型改進的菌種，即經(jīng)濟適用的菌種。特點：短時、快速，定向應(yīng)用：效果很顯著,10.3.1.5基

8、因組shuffling,基因組Shuffling過程,突變：隨機突變獲得單個性狀優(yōu)良的菌株重組：多個菌株的原生質(zhì)體混合、融合、再生，形成第一個融合庫（F1）篩選鑒定：獲得有益突變積累的新性狀菌株多輪循環(huán)：再次融合，得到融合庫F2、F3、F4……., 篩選鑒定……結(jié)果：消除有害突變，組合有益突變新菌種,例1：改良青霉菌生產(chǎn)青霉素的產(chǎn)量,隨機突變育種方法： X-射線(X) 紫外線(UV) 氮芥(N),,,,,,,,,2.5,

9、10 菌落,,,CK,,,E. coli,INV,a,F',,,0.5,,,E. coli,INV,a,F',,,-80℃ stock,,toothpick,,0.5ml,0.5ml,,-80℃ stock,2 菌落,-80℃ stock,例2：菌種篩選示意圖（選擇壓逐步增加）,生長曲線(選擇壓2.5M),黑色：出發(fā)菌種;藍色：耐0.5綠色：耐1.25;紅色：耐2.5,,例3：提高泰樂菌素生產(chǎn)能力,突變育種

10、 基因組shuffling,出發(fā)菌種,效果,Zhang YX, et al., Nature, 415(6872):644-666.,10.3.2 菌種保藏,原因：菌種經(jīng)過多次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化，不污染，隨時為生產(chǎn)供菌。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。措施：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干

11、燥；氧氣：缺氧；營養(yǎng)；缺乏）,保藏方法比較,10.3.3 菌種庫建立與質(zhì)量控制,依據(jù)：GMP對藥品生產(chǎn)的有關(guān)要求和規(guī)定建立各級種子細(xì)胞庫，實施種子批系統(tǒng)管理，進行驗證確保菌種的穩(wěn)定、無污染，保證生產(chǎn)正常有序進行。,建庫的流程,主菌種庫MCB：來源于原始菌種或細(xì)胞培養(yǎng)物工作菌種庫WCB：由主菌種庫或主細(xì)胞庫繁殖而來。,菌種庫的質(zhì)量管理,保藏機構(gòu)－中國,中國典型培養(yǎng)物保藏中心:China Center for Type Cultur

12、e Collection (CCTCC)。中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會,下設(shè)9個庫中國普通微生物菌種保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和細(xì)菌）；武漢所（病毒）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團抗生素所,保藏機構(gòu)－國外,WFCC：World federatio

13、n for culture collections, http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml 美國的典型菌種保藏中心ATCC: American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/日本發(fā)酵研究所IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan英國國家典型菌種保藏所NCTC: National Col

14、lection of Type Culture, London, UK,小結(jié)與要求,生產(chǎn)菌種選育：自然分離獲得出發(fā)菌種，生產(chǎn)選育、誘變和原生質(zhì)體融合、Shuffling，提高菌種生產(chǎn)性能菌種保藏：防止失活和退化（物理手段）建立菌種庫：GMP的要求，質(zhì)量控制，保證生產(chǎn)菌種活力和供給,了解菌種選育和保存的方法及其原理理解其生產(chǎn)應(yīng)用價值，掌握突變和原生質(zhì)體育種技術(shù)能設(shè)計育種研究方案和能實際應(yīng)用。,思考題,（1）如何進行生產(chǎn)菌的分離與篩