w章遺傳病診斷

1、,第十三章 遺傳病的診斷Diagnosis of Genetic Disease概述 臨床常規(guī)診斷 遺傳學檢測 現癥患者診斷 癥狀前診斷 產前診斷,,,第一節(jié) 現癥患者診斷 一、臨床常規(guī)診斷 （一）采集病史家史：親緣、婚姻關系 發(fā)病況 繪系譜 婚史:婚齡 次數 配偶況 近婚生育史：育齡 子女數 流、死產史 產傷 病毒感染（二）癥狀與體征1.智力低

2、下2.特殊面容,,3.特殊氣味4.耳聾5.肝脾腫大 糖原貯積病 半乳糖血癥 粘 多糖病 6.皮膚毛發(fā)異常7.肢體畸形 高 高大 矮 手足8.生殖器變化 ？9.生長發(fā)育遲緩（三）實驗室檢查和輔助檢查,,二 、 系譜分析(pedigree analysis)（一）系譜分析步驟：1.了解成員發(fā)病況2.繪制系譜 講方法……3.判斷遺傳方

3、式、基因型4.估計發(fā)病率5.處理意見注意： 準確 完整 詳細,,（二）孟德爾遺傳病1.AD、AR、XD、XR、YL2.注意事項 1） 外顯不全、隔代2）延遲顯性 3）新突變 4）遺傳異質性 （多種遺傳方式）例：先天性聾啞 AR、AD、XR、環(huán)境 特發(fā) 先天性白內障 CS畸變 AD、AR、胎內感染 特發(fā),,（三）非孟德爾遺傳病1.mt遺傳病 母系遺傳 遺傳瓶頸 晚發(fā)、進行性2.多基因病

4、發(fā)病率比單基因病低（四）基因組印記與動態(tài)突變（略）,,三 、細胞遺傳學(cytogenetics)檢查（一）CS檢查1.CS檢查指征：1）智力低，生長發(fā)育遲緩，先天畸形；2）夫婦之一有染色體異常；3）家族中已有CS病患者；4）多發(fā)性流產婦女及其丈夫； 5）原發(fā)閉經和女性不育；無精子癥和男性不育； 6） 35歲以上高齡孕婦 。,,7）兩性畸形者 8）身材高大，性情粗暴男性 9）惡性血液病患者10）長期接受X線

5、、電離輻射人員11）疑為先天愚型者；疑為脆性X綜合征者。2.CS顯帶分析（前述）（二）性染色質檢查：性染色體數目異常。不分裂細胞：X染色體數=X染色質數+1 Y染色體數=Y染色質數,,（三）熒光原位雜交（前述）（fluorescence in situ hybridization,FISH)用生物素或熒光素標記探針 制備被測標本 變性 分子雜交 熒光顯微鏡檢測

6、例1：21號CS著絲粒探針,,,,,例1,例2,,四、生物化學檢查（一）酶和蛋白質的分析--確定單基因病 參表 利用血液和特定的組織，細胞對酶的活性和蛋白質的含量進行檢測。主要方法有：電泳技術，酶活性檢測，層析技術，免疫技術，氨基酸順序分析技術等。（二）代謝產物的檢測--反映酶活性 利用血液、尿液和羊水對代謝產物進行質和量的檢測。主要方法有：血液濾紙片法，顯色反應。,五、 基因診斷 gene diagnosis

7、 采用分子生物學方法在DNA水平或RNA水平對某一基因進行分析，從而對特定的疾病進行診斷。 可基因診斷的疾病約1000種？,（一）基因診斷的基本技術 *包括： 分子雜交技術；聚合酶鏈式反應(PCR)技術 * DNA序列測定技術； 基因芯片技術,,1.分子雜交技術 （molecular hybridization）1）原理：變性成單鏈→復性成雙鏈（分子雜交）→基因診斷2）過程：制備探針并標記

8、—分離靶DNA—變性處理--探針與靶DNA雜交—DNA或基因檢測3）概念：基因探針（Probe）：是一段帶有標記的，與待測基因有關的核酸序列。探針種類: 基因組探針（genomic probe） cDNA探針（cDNA probe） 寡核苷酸探針（oligonucleotide probe）,4）基因診斷方法（1）斑點雜交法 又稱等位基因特異的寡核苷酸(ASO)探針雜交。 用人工合成的20

9、個堿基左右長度的ASO探針，一般要合成兩種探針：正常探針，突變探針。 將待測的細胞或DNA直接點在硝酸纖維膜或尼龍膜上，將標記有同位素（或其他標記）的變性探針與其進行雜交，通過放射自顯影，判斷受檢基因的有無以及基因的拷貝數，進行基因診斷。,ASO斑點雜交,1986年，胡流清等基于點突變原理，用寡核苷酸探針進行基因診斷。,,,（2）Southern 印跡雜交(略）（ Southern blotting hybridization

10、) 是經分子雜交檢測DNA或基因突變的技術過程：切割——電泳——變性——轉移——80度烘烤固定——雜交——放射自顯影——觀察。（參下圖）,,（3）northern印跡雜交（northern bloting)是RNA雜交的常用方法。原理：應用特異性基因探針分析基因的轉錄，轉錄量的變異，mRNA的大小。過程:提取總RNA… p193(4)western印跡雜交(western bloting)是在蛋白質水平檢測或研

11、究基因表達與功能的方法。過程:提取蛋白質…p194(5)原位雜交（前述）,2.聚合酶鏈反應 （polymerase chain reaction，PCR） 聚合酶鏈反應技術是在體外迅速的選擇性擴增特定的靶DNA的方法。PCR的原理：（1）合成引物：按靶DNA片段的5`和3`端的堿基順序各合成兩條引物（長約20個堿基的寡核苷酸）；（2）建立反應體系：將待測DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP），引物和耐熱DNA聚

12、合酶（Taq 酶）；,（3）反應液進行熱循環(huán)：每一周期經過變性（92-95℃），復性（40-60℃）和延伸（65-72℃）三個階段產生倍增的DNA。一般進行20-40個周期。,PCR相關技術及應用：（1） PCR-ASO ：PCR/等位基因特異性寡核苷酸探針雜交PCR擴增 用ASO探針雜交 （2）PCR-RFLP：PCR-限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析PCR擴增 限制酶酶切 電泳（3）RT-PCR：反轉

13、錄PCR 反轉錄酶 合成cDNA（4）多重PCR：用兩對以上引物 （5）PCR-SSCP：PCR-單鏈構象多態(tài)性分析在突變點附近設計引物—PCR擴增—突變DNA構象變化—電泳分離—DNA測序 （6）PCR-DGGE （7）定量PCR,PCR-SSCP,1989年，Orita等建立的PCR產物單鏈DNA凝膠電泳技術。,1：正常人 2,4,5：純合體患者 3：雜合體(2的弟弟)左為泳動變位模式：a 正常人；b 純合體患者

14、,PCR-SSCP,3.DNA測序技術(DNA sequenceing Maxan和Gilbert首先建立了化學方法，Sanger建立了DNA測序的酶學方法。DNA自動測序法：以不同熒光色素標記的四種不同脫氧核苷酸為原料進行酶促合成反應，經過凝膠電泳分離，應用激光分析及計算機處理就能直接讀出堿基順序。而且測序的長度可以達到1000bp以上。,DNA測序（DNA Sequencing)是檢測未知突變和已知突變基因的最基本和最重

15、要的實驗手段。,4.基因芯片技術 （gene chip)　基本原理：核酸雜交基本過程：將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，然后按堿基配對原理進行雜交，再通過熒光檢測系統等對芯片進行掃描，并配以計算機系統對每一探針上的熒光信號做出比較和檢測，得出所要的信息。,,特點：是一種高效、準確的DNA序列分析技術，可同時對千余種基因的表達

16、水平、突變、多態(tài)性進行檢測。例：β地貧檢測,（二）基因診斷的途經和方法(略）1.途徑1)直接診斷 —— 檢測突變基因 直接診斷是直接檢測致病突變的基因。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產物，以探查基因有無突變、缺失等異常及其性質，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病。 當致病基因的某種突變類型與發(fā)病有直接的因果關系,或者對致病基因以及分子機制已完全了解,或者對致病基因

17、以及分子機制部分了解但已知其中規(guī)律,可應用此途徑。,2) 間接診斷 —— 基因連鎖分析 當致病基因雖然已知但其異常尚屬未知或突變類型較多時；或致病基因本身尚屬未知時，但被檢測基因有緊密連鎖的DNA多態(tài)標記，可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。 連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點作為標記。RFLP、VNTR、SSC

18、P、AMP－FLP等技術均可用于連鎖分析。,2.基因診斷的方法選擇： 各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。根據對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。,,遺傳的基因診斷方法基因異常 方法 探針、引物或限制酶基因缺失 基因組DNA印跡雜交\PCR擴增 缺失基因的探針

19、 引物包括缺失或在缺失部位內點突變 RFLP分析\ASO雜交 突變導致其切點消失的限制酶 PCR產物的多態(tài)性分析 正常和異常的ASO探針 （RFLP、SSCP、DGGE） 引物包括突變部位基因已知 基因內或旁側序列多態(tài)性

20、 基因內或旁但異常不明 （RFLP、 SSCP、AMP－FLP） 側序列探針或引物 連鎖分析 基因未知 與疾病連鎖的多態(tài)性， 與疾病連鎖的多態(tài) 如SSCP、AMP－FLP連鎖分析， 位點探針或引物 RFLP位點單體型連鎖分析,,,（三）基因診斷在遺傳病診斷中的應用1． 對單基因病的基因診斷（

21、1）點突變型遺傳病的基因診斷,①鐮形細胞性貧血的基因診斷ASO探針診斷法：,,RFLP診斷法：RFLP(restriction fragment length polymorphism): 不同人的DNA用同一種限制酶切割，可切出不同長度的片段。例：Hbs病β6 GAG（谷）→GTG（纈）MstⅡ可識別并切割βA:CCTGAGG序列 不能切割βs: CCTGTGG序列

22、 此切點消失,,,,,,IVS-Ⅰ,,,,,1.15kb,MstⅡ切點,,,,,,,,1.15kb,0.2kb,HbA,,,,1.35kb,A→T HbS,,,,,,,,1.15kb,1.35kb,0.2kb,,,,正常,雜和體,HbS病,失,②無過氧化氫酶血癥（acatalasemia) （略） 是一種常染色體隱性遺傳病，患者過氧化氫酶活性只有正常人的0.2%～0.4%，雜合體血液中過氧化氫酶活性則處于中間水

23、平。過氧化氫酶基因由13個外顯子和12個內含子組成。應用32P標記PCR反應中底物方法，擴增第4個外顯子和內含子附近的203bp片段，應用SSCP法可清楚地判斷患者和雜合體。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,aa/aa aa/- aa/a- a-/-- --/-,14kb10kb,,,,,10kb 4kb,BamH I,BamH I,左側：16號染色體上攜有數目不同的

24、基因右側：a基因探針雜交的結果,① ?-地貧基因缺失的診斷,正常,貧血癥狀,攜帶者,HbH,（2）基因缺失型遺傳病的診斷,RFLp診斷（略）：,,PCR診斷：（polymerase chain reaction ,)PCR原理（參下頁舉例）,950C → 560C →720C,變性 退火 延伸,,,,例：診斷Barts胎兒水腫綜合征。1）建立反應體系 2）DNA擴增3）電

25、泳檢測,,待測DNA,α基因引物,dTNP,Taq酶,,,,,950C → 560C →720C,變性 退火 延伸,,,,,,,,,,,,α基因,②DMD／BMD的缺失型診斷：,（3）基因異常不明的遺傳病的診斷 以苯丙酮尿癥( PKU )的基因診斷為例。RFLP分析： p202上,一個PKU家系的RFLP單體型分析 （略）,（略）,單體型分析,,（略）,ASO Hybridization法：,,

26、PKU家系PAH基因STR連鎖分析（略）,2．多基因遺傳病的基因診斷（略） 人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎，易感基因多態(tài)性的檢測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機制，有助于對疾病的診斷和分類。 目前已經發(fā)現一些多基因病相關基因，如載脂蛋白E基因（ApoE）的多態(tài)性與阿爾茨海默?。ˋD）有高度相關性，血管緊張肽轉換酶基因的多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和心肌梗死高度相關。,3． 對腫瘤的基因診斷ras基因突變的檢測

27、 ras基因突變的檢測可采用PCR-ASO方法進行，已知ras基因突變的熱點在12、13及61密碼子。 p53基因的檢測 目前常用PCR法進行檢測p53突變的熱點是外顯子5-8，一般可先選用外顯子5-8的引物進行擴增，其后再進行突變位點的詳盡分析，甚至測序。另一初步檢測p53基因突變的方法為PCR-SSCP，然后測序。,（五）疾病基因診斷的展望未來的基因診斷主要發(fā)展方向 *胚胎著床前診斷—在囊胚8個細胞期，通過對其

28、中一個細胞的染色體核型分折和原位雜交，從而將人類的遺傳缺陷控制在最早期階段； *母體外周血中胎兒細胞分析技術； *對常見病、多發(fā)病如心血管系統疾病、糖尿病、精神疾病、神經系統疾病、惡性腫瘤、哮喘、近視眼等進行分子診斷。,第二節(jié) 癥狀前診斷（pre-symptomatic diagnosis） 指在遺傳病的臨床癥狀出現前所作的診斷。 是針對一些發(fā)病年齡延遲遺傳病 (AD、AR、XR等) 的診斷方法。這些個

29、體往往早期表型正常，延遲發(fā)病，如果能在出現癥狀之前作出診斷，可以早期治療，并避免將致病基因傳遞給后代，減少遺傳病的發(fā)病率。,癥狀前診斷方法有4種：1．家系分析法和風險估計 2．生化學檢查3．基因分析 4. 新生兒篩查（neonatal screening）是對已出生的新生兒進行某些遺傳病的診斷，是出生后預防和治療某些遺傳病的有效方法。,,第三節(jié) 產前診斷（prenatal diagnosis)定義：產前診斷即宮內診斷 生

30、前 遺傳病畸形、性別……一 、產前診斷的對象 1.夫婦之一有CS畸變。2.35歲以上高齡孕婦。3.夫婦之一有神經管畸形或生過畸形兒。4.夫婦之一有先天代謝缺陷或生過該病患兒。5.有原因不明的習慣性流產、死胎、死產及新生兒死亡的孕婦。,,7.羊水過多。8.夫婦之一有致畸因素接觸史。9.有遺傳病家族史、近婚的孕婦。二 、產前診斷的方法1、X線：24周后 骨骼畸形。2、超聲波：無痛、無損傷。3、胎兒鏡：18-

31、20周 直接觀察 取材4、羊膜穿刺術（amniocentesis)：16-18周 取標本（參下圖）5、絨毛吸取術(chorionic villus sampling)：7-9周,,非侵襲性,,,經腹壁羊膜腔穿刺,,,經腹壁取絨毛樣品,,經陰道、子宮頸進入子宮絨毛樣品,,6、臍帶穿刺術：約18周。胎血取樣。7、孕婦外周血分離胎兒有核紅細胞：前景 胎兒游離DNA 無創(chuàng)性8、母體血清三項篩查： Down綜合征：AFP

32、↓uE3↓HCG↑9、實驗室檢查 染色體 生化 基因 10、植入前診斷（preimplantation genetic diagnosis,PGD) ：植入前體外受精、培養(yǎng)、檢測。 過程：體外受精、培養(yǎng)—8細胞時胚胎組織微活檢—染色體、基因檢測—據結果決定是否培養(yǎng)與移植。 前景,,第四節(jié) 皮膚紋理分析(略）概述皮紋—手指、掌面、足趾、（足/庶）面的嵴紋和溝紋走向的不同形成的皮膚紋理。人胚12~13周

33、一卵雙生 0.953 多基因遺傳 終生性輔助診斷手段（一）正常皮紋1.指紋 指端部的皮紋1）弓形紋（arch,A)特點：嵴紋由一側走向另一側,,2）箕形紋（loop,L)特點：嵴紋從一側發(fā)出，折回原側，有一三叉點尺側～ 橈側～3）斗形紋(whorl,W)特點：兩個三叉點圖 環(huán)形斗 螺形斗 絞形斗,,4)總指嵴紋數Total finger ridge count,

34、TFRC)十指嵴紋總數2.掌紋1）指間花紋2）大、小魚際花紋3）主線式A 、B 、C 、D主線A→小魚際4）t三叉與atd角正常人 1.4cm 410 掌紋圖,,3.手掌褶與指褶（1）手掌褶（圖→）1）正常2）通貫手（遠近合一）正常人4%±3）變異Ⅰ型4）變異Ⅱ型5）悉尼手（2）指褶小指有意義,,4.拇趾球部皮紋7形：斗、遠側箕、腓箕、脛箕、近弓、腓弓、脛弓

35、（二）皮紋檢查方法（三）CS病患者皮紋特點1. Town syndrome (唐氏綜合征)1）∠atd＞600 (82%)2) 脛弓（72%） 3）通貫手（31%）4）小指只一指褶（17%）5）箕↑、弓↑、TFRC↓,,,,,,,脛弓,,,2.18三體綜合征（1）弓紋↑（80% 7↑）（2）小指1指褶（40%）（3）通貫手（25%）（4）∠atd＞700 （25%） 3.13三體綜合征 （1）弓紋↑（2