藥物分析藥物分析方法

1、3.5,藥 物 分 析 方 法,藥物分析方法,核磁、質(zhì)譜等技術(shù),,,,,一、常規(guī)的化學分析法,1. 容量（滴定）分析法 將一種標準溶液滴加到待測物質(zhì)的溶液中，直到與待測物質(zhì)按化學計量關(guān)系定量反應(yīng)為止，然后根據(jù)標準溶液的濃度和所消耗的體積，計算待測物質(zhì)含量的方法。,基本術(shù)語,滴定：將滴定劑通過滴管滴入待測溶液中的過程。滴定劑（標準溶液）：濃度準確已知的溶液。指示劑：滴定分析中能發(fā)生顏色改變而指示終點的試劑。,滴定

2、終點：滴定分析中指示劑發(fā)生顏色改變的那一點。,2、 滴定分析法的分類,A）按化學反應(yīng)類型分類酸堿滴定法：質(zhì)子轉(zhuǎn)移絡(luò)合滴定法：生成絡(luò)合物氧化還原滴定法：電子轉(zhuǎn)移沉淀滴定法：生成沉淀,滴定操作,2、 滴定分析法的分類,B）按滴定方式分類直接滴定：標液滴定待測物，直到所滴加的試劑與待測物質(zhì)按化學計量關(guān)系定量反應(yīng)為止。返滴定法：先用過量標準溶液A與待測物反應(yīng)后，再用另一種標準溶液B滴定剩余的A溶液。置換滴定： 先用適當試劑與待測物

3、質(zhì)反應(yīng)，定量置換出另一種物質(zhì)，再用標準溶液去滴定該物質(zhì)的方法。,,滴定分析對化學反應(yīng)的要求：a.反應(yīng)定量、完全b.反應(yīng)迅速c.具有合適的確定終點的方法特點： 簡便、快速；適于常量分析；準確度高； 應(yīng)用廣泛。,Ch.P（2005）中采用的滴定分析法：,酸堿滴定、 銀量法、 碘量法、 亞硝酸鈉滴定法、 配位滴定法、 雙相滴定法、 高錳

4、酸鉀滴定法、 溴酸鉀滴定法、 碘酸鉀滴定法、 高碘酸鉀滴定法等。,2.重量分析法,重量分析法，是將被測組分與試樣中的其他組分分離后，轉(zhuǎn)化成一定的稱重形式，然后用稱重方法測定該組分的含量。重量分析法的分類揮發(fā)重量法 用加熱等方法將待測物中揮發(fā)性成分揮發(fā)后，稱量殘渣，由樣品減少的量來計算該揮發(fā)組分的量。常用來測定物料的水分、揮發(fā)分和灰分。,應(yīng)用,例如： 氯化鋇中結(jié)晶水含量的測定 水分在試樣中存在的形式：

5、吸附水，結(jié)晶吸附水：在105~110 ℃烘干結(jié)晶水：根據(jù)具體的物質(zhì)決定，例如 BaCl2·2H2O可以在120~125 ℃烘干。,,萃取重量法 溶劑萃取待測物后，將萃取液蒸干，稱量干燥物重量。Ch.P（2005）中收載苯妥英鈉的含量測定就是利用萃取重量法。（P40~41）,,沉淀重量法 利用沉淀反應(yīng)，將待測物轉(zhuǎn)化為沉淀，分離并稱定其重量。,沉淀重量法的應(yīng)用,,濾，洗灼燒，800℃,,

6、SO42- + BaCl2 BaSO4 BaSO4,,濾，洗灼燒,,Fe3+ + NH3·H2O Fe(OH)3 Fe2O3,Ch.P（2005）中收

7、載甲磺酸酚妥拉明的含量測定。P41,儀器分析法,色譜分析色譜法溯源俄國科學加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見諸于俄文的文獻1906年正式命名（見諸文獻）色譜法；Chromatography50年代開始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代,色譜的分類,氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相,高效液相色譜,High Performance L

8、iquid Chromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器……廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥 / 環(huán)保 / 石化 / 生命科學 / 食品及農(nóng)業(yè)……,,,,,液相色譜的基本流程圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,流動相,泵,色譜柱,檢測器,,,,,,,,,進樣閥,泵輸液,分離,檢測,記錄,進樣,HPL

9、C的儀器配置,高壓輸液泵,自動進樣器,色譜柱及柱溫箱,檢測器,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),流動相,色譜圖：HPLC圖形結(jié)果,色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。,← 色譜峰,保留時間（分）,基線↓,,,峰高,,,峰寬,響應(yīng)值,液相色譜應(yīng)用：分析型液相色譜,定量分析主要基于與標準品的比較是其最大應(yīng)用領(lǐng)域定性分析：基于樣品的保留時間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測器對定

10、量及定性分析的要求靈敏度、精度及準確度的要求樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力容易使用,HPLC在藥物分析中的應(yīng)用,常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽?yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應(yīng)用：光學異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強)藥物

11、的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。HPLC應(yīng)用示例P55,氣相色譜法,基本原理 GC是以惰性氣體作為流動相，利用試樣中各組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同，實現(xiàn)分離的目的。當汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運行時，組分就在其中的兩相間進行反復(fù)多次的分配（吸附－脫附－放出）。由于固定相對各種組分的吸附能力不同（即保存作用不同），各組分在色譜柱中的運行速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，順序離開色譜柱進入檢測器

12、，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰 。,氣相色譜儀,,,,,氣相色譜儀通常由五部分組成：Ⅰ 載氣系統(tǒng)：氣源、氣體凈化器、供氣控制閥門和儀表。Ⅱ 進樣系統(tǒng)：進樣器、汽化室。Ⅲ 分離系統(tǒng)：色譜柱、控溫柱箱。 Ⅳ 檢測系統(tǒng)：檢測器、檢測室。Ⅴ記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀、色譜工作站。,氣相色譜結(jié)構(gòu)流程,1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計; 6-壓力表；7-進樣器；8-色譜柱；9

13、-熱導(dǎo)檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；,載氣系統(tǒng),進樣系統(tǒng),色譜柱,檢測系統(tǒng),溫控系統(tǒng),,,,,,,應(yīng)用舉例,定量分析：a. 色譜峰的測量:以峰的起點和終點的聯(lián)線作為峰底。從峰高極大值對時間鈾作垂線，對應(yīng)的時即為保留時間。從峰頂至峰底間的線段即為峰高。b. 計算:由色譜峰量出各組分的峰高，然后在各自的校準曲線上查出相應(yīng)的待測物濃度。定性結(jié)果： 根據(jù)標準譜圖各組分的保留時間確定被測試樣中出現(xiàn)的組分數(shù)目和

14、組分名稱。,苯系物氣相色譜圖,平面色譜,在平面上進行分離的一種色譜方法，主要包括薄層色譜法和紙色譜法。,分類薄層色譜法：吸附薄層色譜法 分配薄層色譜法 分子排阻薄層色譜法 紙色譜法：分配薄層電泳法,定性參數(shù),比移值(Rf值)溶質(zhì)移動距離與流動相移動距離之比。Rf =L/L0 L為原點（origin）至斑點中心的距離，L0為原點至溶劑前沿（solvent front）的距離 與組分及色譜條

15、件有關(guān),薄層色譜法,固定相（吸附劑或載體）涂布成一均勻薄層，點樣，（密閉的容器中）展開，斑點顯色，（與對照物質(zhì)）比較進行定性定量。操作步驟：制板（均勻） →點樣（集中） →展開　(多種方式) →顯色（紫外燈或顯色劑）,(thin layer chromatography；TLC),定性和定量分析,定性分析 比較Rf值、斑點顏色或熒光常采用已知標準物質(zhì)對照（同一板上展開）多種展開系統(tǒng)的Rf值與對照品一致。定量分析　洗脫

16、法直接定量法　　　　1.目視比較法（如雜質(zhì)限度檢查方法）　　　　2.薄層掃描法,應(yīng)用示例,中藥中化學成分的分析例1，如右上圖，不同產(chǎn)地的甘草的TLC圖譜。,例2，某中藥的TLC圖譜與HPLC圖譜對照。,光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強度來進行分析的方法。,,吸收光譜分析發(fā)射光譜分析分子光譜分析原子光譜分析,光譜分析,在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來

17、的分析方法稱為吸光光度法,主要有: 紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.5?1000 ?m ,主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定。 紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200?400 nm（近紫外區(qū)） ，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。 可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400?750 nm ，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。,紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible

18、 spectrophotometry, UV-VIS),它是利用物質(zhì)的分子或離子對紫外-可見光的吸收作用，對物質(zhì)進行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜，即為紫外光譜。,紫外光譜的表示法,紫外光譜圖是由橫坐標、縱坐標和吸收曲線組成的。,橫坐標表示吸收光的波長，用nm（納米）為單位。 縱坐標表示吸收光的吸收強度，可以用A(吸光度)、T(透光率)、1-T(吸收率)中的任何一

19、個來表示。 吸收曲線表示化合物的紫外吸收情況。 曲線最大吸收峰的橫坐標為最大吸收波長。,對甲苯乙酮的紫外光譜圖,在藥物分析中的應(yīng)用,UV-Vis分光光度法主要用于藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定中。應(yīng)用一：藥品的鑒別測定最大吸收波長 例如三唑侖，用無水乙醇制成每1ml中含5μg的溶液，照分光光度法測定，在221nm處有最大吸收。測定最大吸收波長和最小吸收波長 如五氟利多測定最大波長和不同波長的吸收值比值測定吸

20、收系數(shù),例: 在頭孢類抗生素中，常在性狀項下規(guī)定吸收系數(shù)，以控制藥品的質(zhì)量。,應(yīng)用二：藥品的雜質(zhì)檢查,用分光光度法對藥品中的特殊雜質(zhì)進行檢查，可將雜質(zhì)用適當?shù)娜軇┨崛?，與主成分分離后測定，還可用雜質(zhì)的顯色反應(yīng)進行測定。 如維生素B2中感光黃素的檢查 取本品25mg，加無乙醇氯仿10ml，振搖5min，濾過，濾液照分光光度法，在440nm處測定，吸收度不得過0.016。,應(yīng)用三：藥品的含量測定,UV-Vis分光光度

21、法簡便，快速，在藥物的含量測定中應(yīng)用廣泛。 含量測定時通常選擇最大吸收波長處測定供試品的吸收度，用對照品或百分吸收系數(shù)（ ）計算藥品的含量。如藥典中 乙胺嘧啶片的含量測定 P70,紅外光譜法,藥物受到紅外區(qū)電磁波的輻射，激發(fā)分子的振動和轉(zhuǎn)動能級的變化，產(chǎn)生紅外吸收光譜。有機分子中的許多官能團具有特征的振動能級，相應(yīng)于IR光譜一定區(qū)域的特征吸收帶，可用于鑒別這些官能團。此外，有大量的標準光譜和數(shù)據(jù)庫可資比較，常?？梢詫?/p>

22、藥物結(jié)果作出確切的鑒定。,紅外光譜分析的應(yīng)用,在藥物分析中，紅外光譜主要用于定性鑒別。 定性鑒別時，主要著眼于供試品光譜與對照光譜全譜譜形的比較，即首先是譜帶的有與無，然后是各譜帶的相對強弱。,若供試品的光譜圖與對照光譜圖一致，通?？膳卸▋苫衔餅橥晃镔|(zhì)（除光學異構(gòu)體）。若兩光譜不同，則可判定兩化合物不同。,示例1：紅外光譜鑒別青霉素類藥物P78示例2：芐醇的紅外光譜,質(zhì)譜分析,質(zhì)譜法是一種按照離子的質(zhì)核比（m/

23、z）大小對離子進行分離和測定的方法。分析時，首先將分子離子化，然后利用離子在電場或磁場中運動的性質(zhì)，把離子按質(zhì)核比大小排列成譜，此即為質(zhì)譜。質(zhì)譜法的主要作用是：（1）準確測定物質(zhì)的分子量（2）根據(jù)碎片特征進行化合物的結(jié)構(gòu)分析,質(zhì)譜分析過程和原理,質(zhì)譜法分類,進樣系統(tǒng)(inlet system) 離子源(ion source)質(zhì)量分析器（mass analyzer）檢測器（detecter） 真空系統(tǒng)（Vacuu

24、m system）,質(zhì)譜儀的組成,1.氣體擴散2.直接進樣3.氣相色譜,1.電子轟擊2.化學電離3.場致電離4.激光,1.單聚焦 2.雙聚焦 3.飛行時間4.四極桿,離子源的真空度應(yīng)達到10-3-10-5 Pa，質(zhì)量分析器應(yīng)達到10-6 Pa。,有機質(zhì)譜譜圖及信息表達,二氯甲烷的電子轟擊質(zhì)譜,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為一種高效的定性定量分析工具。中藥未知成分的鑒定，LC-MS測定雷公藤的化

25、學組分揮發(fā)油化學成分的GC-MS分析藥物代謝研究，液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法檢測體液中士的寧、馬錢子堿及其主要代謝物。,質(zhì)譜在藥物分析結(jié)構(gòu)鑒定中起著重要的作用，主要用于判定藥物的分子量和分子式。,電化學分析法,電化學分析是根據(jù)電化學原理建立起來的一類分析方法。 電化學分析法主要是應(yīng)用電化學的基本原理和技術(shù)，研究在化學電池內(nèi)發(fā)生的特定現(xiàn)象，利用物質(zhì)的組成及含量與它的電化學性質(zhì)的關(guān)系而建立起來的一類分析方法。,定性和定量分析依據(jù),分

26、析方法：設(shè)計電池，使得試樣溶液成為電化學電池的組成部分，然后測量電池的某些參數(shù)（電壓、電流、電阻、電量等），或根據(jù)這些參數(shù)的變化來進行待測組分的定量或定性分析。基本原理 利用電池電動勢與試液中離子活度之間一定的數(shù)量關(guān)系，從而測得離子的活度。,,電化學分析法分類 電位分析法 庫侖分析法 極譜分析法 電導(dǎo)分析法 電解分析法電位分析法特點 靈敏度、選擇性和準確度都較高

27、 被分析物質(zhì)的最低量接近10-12mol數(shù)量級。,電化學方法的應(yīng)用,電位滴定法是藥物分析中應(yīng)用最多的電化學方法電位滴定法實際是用電位法指示滴定分析終點的方法。即在滴定液中加入指示電極和參比電極，由滴定過程中指示電極的電位突躍來指示終點。,示例,例1.泛影酸的含量測定,Ch.P(2005)曙紅鈉為指示劑，BP采用電位法指示終點。,例2.電位滴定法測定復(fù)方氯丙那林魚腥草素鈉片中魚腥草素鈉的含量。P90,,,多維色譜分析技術(shù)新型

28、色譜技術(shù)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)微流控芯片和生物芯片分析技術(shù),現(xiàn)代分析新技術(shù),,藥物分析方法的發(fā)展趨勢,從經(jīng)典的化學分析方法向儀器分析方法轉(zhuǎn)變。儀器分析的特點:（1） 樣品適用性廣，特別適用于微量、痕量組分含量分析（含量<1%，測量的相對誤差為1~10%）（2） 適合于復(fù)雜體系的分析分離（3）操作簡便快速（4）最適用于生產(chǎn)過程中的控制分析。,,,儀器分析的發(fā)展趨勢： 方便、快捷；多功能；環(huán)保、經(jīng)濟；高質(zhì)量（準確度