南林895楊抗蟲轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、　　本研究以南林895楊葉片為材料，在建立高效組培再生體系的基礎(chǔ)上，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，開展了抗蟲基因蘇云金芽孢桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白(Bt)基因和豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTⅠ)基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，取得的主要進(jìn)展如下：1.高頻組培再生體系的建立：通過對(duì)基本培養(yǎng)基的篩選，激素種類和濃度的調(diào)整，培養(yǎng)條件的選擇等，獲得了高效分化再生培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.002mg/L，分化率為100﹪，每個(gè)葉盤產(chǎn)生大量的叢生芽，為遺傳轉(zhuǎn)

2、化工作提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；2.遺傳轉(zhuǎn)化中選擇壓的確定：所用的篩選標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NptⅡ)基因，在遺傳轉(zhuǎn)化中采用卡那霉素作為篩選轉(zhuǎn)化植株的選擇劑。經(jīng)過對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明采用Kan20mg/L作為篩選時(shí)的選擇壓?！　?.遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：研究了影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的各個(gè)因素，得出最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件是：預(yù)培養(yǎng)3d，菌液濃度OD6001.0～1.3左右，侵染時(shí)間20min，共培培養(yǎng)基中加AS120～200mg/L，pH調(diào)為5.8，不去除

3、CoCl2·6H2O，共培養(yǎng)溫度設(shè)為28℃，共培養(yǎng)4d。在此優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系下，美洲黑楊的轉(zhuǎn)化率由4.5﹪增加到28.7﹪，提高了6倍；　　4.轉(zhuǎn)抗蟲基因植株的獲得和分子檢測：在經(jīng)卡那霉素嚴(yán)格篩選獲得的22株轉(zhuǎn)Bt基因和5株轉(zhuǎn)CpTⅠ基因的再生植株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果轉(zhuǎn)Bt基因的Kanr再生植株DNA樣品中有18株呈陽性，轉(zhuǎn)CpTⅠ基因的Kanr再生植株DNA樣品中有1株呈陽性，試驗(yàn)結(jié)果初步證明目的基因已被導(dǎo)入到美洲黑楊雜種基因組中；