實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程藥理藥效研究-動(dòng)物模型

1、動(dòng)物胚胎工程,——轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物和 克隆動(dòng)物制作的胚胎學(xué)基礎(chǔ),,管敏強(qiáng),溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,第一節(jié) 動(dòng)物胚胎工程概述,現(xiàn)代動(dòng)物胚胎工程是指所有對配子和胚胎進(jìn)行操作的技術(shù)方法，它的研究重點(diǎn)在雌、雄生殖細(xì)胞到囊胚的各個(gè)發(fā)育階段上實(shí)施體外操作技術(shù)。,工程之一：胚胎移植工程之二：胚胎培養(yǎng)工程之三： 胚胎保存工程之四： 胚胎分割工程之五： 體外受精工程之六: 顯微注射工程之七： 卵的激活與孤雌發(fā)育工

2、程之八： 細(xì)胞核移植與克隆技術(shù),工程之一 胚胎移植,一、概 述 （一）概念 胚胎移植（embryo transfer，ET）：又稱受精卵移植，是將體內(nèi)或體外生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物早期胚胎移植到同種的生理狀態(tài)相同的雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù)，也稱借腹懷胎。 提供胚胎的個(gè)體——供體（donor） 接受胚胎的個(gè)體——受體（recipient）,?為了使供體♀多排卵，通常采用超排（superovulat

3、ion）；?國外將常規(guī)的胚胎移植稱為超數(shù)排卵胚胎移植或稱為多排卵胚胎移植（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）；?目前，用體外生產(chǎn)胚胎（in vitro production, IVP）技術(shù)或克隆（cloning）技術(shù)等方法也可以生產(chǎn)胚胎，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)胚胎的來源，降低了ET的成本。,二、胚胎移植歷史,表1 哺乳動(dòng)物胚胎生物技術(shù)發(fā)展主要事件簡表,1.1初始階段1890-1900 W

4、.Heape將安哥拉兔和荷蘭兔的受精卵分別移植到比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，分別獲得仔兔2只。1.2初級階段1900-1950 主要由英美科學(xué)家在家兔、綿羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。1.3發(fā)展階段1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手術(shù)法移植成功。胚胎移植成功率達(dá)70-80%.,1.4實(shí)用化初始階段 1970-1980 加美開始成立牛胚胎移植公司，1973年牛凍胚移植成功（英）.1.

5、5實(shí)用化研究階段 1982- 大規(guī)模胚胎移植、核移植、嵌合體、胚胎分割、性別鑒定、體外受精在英美日德廣泛開展?？寺⊙蛘Q生。,三、胚胎移植的意義,科研用途：1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物和克隆動(dòng)物、核移植、胚胎切割、體外受精等獲得目的動(dòng)物 2.動(dòng)物的微生物凈化 其它用途： 1.稀有品質(zhì)動(dòng)物的擴(kuò)群（如高產(chǎn)奶牛和瀕危動(dòng)物) 2.不孕不育癥的治療(顯微受精),四、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)

6、與基本原則,,,,,（一）生理學(xué)基礎(chǔ),（二）胚胎移植遵 循的基本原則,（三）開展胚胎移植 的條件,,1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ),胚胎的遺傳特性不受受體雌性動(dòng)物的影響,www.themegallery.com,2. 胚胎移植的基本原則,,同一解剖位置：空間環(huán)境的一致性,,同一生理階段：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性,,同一物種：供

7、體和受體在分類學(xué)上的相同屬性,,,,胚胎的 質(zhì)量,胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響。,包括人員的技術(shù)水平及所需的設(shè)備；,從優(yōu)良雌性動(dòng)物獲得大量胚胎。,3.開展胚胎移植的條件,,五、胚胎移植的基本步驟,供、受體的選擇供體的超數(shù)排卵與人工授精受體的同期發(fā)情胚胎的收集胚胎的檢查和評定胚胎的移植,1.供體和受體的選擇,供體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價(jià)值供體生殖機(jī)能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)

8、強(qiáng)健受體應(yīng)容易購買，繁殖性能好，對地方適應(yīng)性強(qiáng)，體型中上等，非優(yōu)良品種受體健康狀況良好，已進(jìn)入發(fā)情季節(jié)供受體發(fā)情時(shí)間應(yīng)接近或一致,2. 超數(shù)排卵,超數(shù)排卵是一種不正常的排卵，經(jīng)外源激素處理的雌性動(dòng)物，可以改變性周期，可以超常數(shù)的排卵，甚至可以超常數(shù)十幾倍。在施行小鼠、兔子和金黃地鼠超數(shù)排卵研究中，曾有1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只免取得胚胎88枚，有1只金黃地鼠采得72枚胚胎的記錄。,超排所用激素主要有三類。第一類是FSH（促

9、卵泡激素）及其類似物，第二類是LH（促黃體激素）及其類似物，第三類是外源性促排卵類激素如GnRH 等類似物，以及這些激素的復(fù)合制劑。,超數(shù)排卵的意義 采用超數(shù)排卵可大大增加每次的排卵數(shù)量在科研上可以在短時(shí)間內(nèi)取得大量的卵和胚胎，可以滿足胚胎工程研究、遺傳工程研究和建立胚胎庫的需要。大大縮短了研究周期在生產(chǎn)中，可以提高優(yōu)秀動(dòng)物的繁殖數(shù)量，提高產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。,3. 同期發(fā)情,利用外源激素制劑或其它生物學(xué)手段人為地控制并調(diào)整一群

10、雌性動(dòng)物發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情，以便有計(jì)劃地合理地組織配種，稱為同期發(fā)情或同步發(fā)情。要想使雌性動(dòng)物發(fā)情，則必須控制P的濃度，即控制黃體的“消”，“長”——即是控制母畜發(fā)情的關(guān)鍵。 消： 縮短黃體期 PG處理 長： 人為延長黃體期 P處理 利用縮短黃體期的前列腺素或延長黃體期的孕酮,通過縮短和延長黃體期進(jìn)行同期發(fā)情,縮短黃體期（PGF2α）,延長

11、黃體期（孕激素）,正常發(fā)情周期正常黃體期和卵泡期,大動(dòng)物如山羊綿羊等動(dòng)物主要采用前列腺素類的激素如用15-甲基PGF2α或氯前列烯醇等激素使黃體溶解來達(dá)到同期發(fā)情的目的。小型嚙齒類動(dòng)物如小鼠可通過挑選發(fā)情母鼠與結(jié)扎公鼠交配，來達(dá)到同期發(fā)情的目的，稱為假孕母鼠.,動(dòng)物的同期發(fā)情,定義：利用沖冼液將胚胎從生殖道內(nèi)沖出，并收集在器皿中。,4.胚胎的收集,胚胎收集的時(shí)間：一般在配種后3~8d，發(fā)育至4~8細(xì)胞期后；牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期

12、或胚泡早期進(jìn)行收集和移植。,胚胎沖洗液:,沖胚液現(xiàn)多用杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）、合成輸卵管液（SOF）、布林斯特液等。 沖胚液可加1-5％牛血清白蛋白，也可不加；培養(yǎng)液需加入0.1-3.2％的牛血清白蛋白，或用1-50％犢牛血清代替（用前56℃30min滅活）,胚胎收集方法:,手術(shù)法 輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚 子宮角沖胚 非手術(shù)法 二通管 三通管,,5.胚胎的檢查與鑒定,胚胎的檢查是指在體視鏡下從沖卵液回收胚胎。同時(shí)

13、檢查胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。對發(fā)育正常的胚胎供移植或體外培養(yǎng)和保存。,胚胎的檢查項(xiàng)目： 1、受精卵整體的形態(tài)和體積大小； 2、透明帶形狀，厚度及損傷程度； 3、發(fā)育正常胚胎的卵裂球應(yīng)該具有整齊的外形，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚齡一致； 4、卵細(xì)胞表面顆粒的狀態(tài)和多少等。,1（Ａ）級：優(yōu)秀。胚胎細(xì)胞團(tuán)呈均勻?qū)ΨQ的球形，單個(gè)卵裂球（或細(xì)胞）的　　　　　　　　　　　　　　　大小、顏色、密度一致，胚胎的發(fā)育階段與

14、預(yù)期的發(fā)育階段一　　　　　　　　　　致。不規(guī)則的細(xì)胞相對較少。至少有85%的細(xì)胞物質(zhì)是完整的、　　　　　　　　　具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。這些判斷是以在卵周隙中突出細(xì)胞與正　　　　　　　　　　常胚胎細(xì)胞的百分比為基礎(chǔ)的。透明帶必須是光滑的而不應(yīng)是凹　　　　　　　陷的或平坦的，否則會(huì)使胚胎黏附于培養(yǎng)皿或細(xì)管上。 2 （Ｂ）級：良好。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞的顏色和密度存在　　　　　　　一定的不規(guī)則。至少有50%的細(xì)胞

15、結(jié)構(gòu)是完好的、具活性的胚胎　　　　　　　細(xì)胞團(tuán)。 3 （Ｃ）級：質(zhì)差。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞的顏色和密度存在　　　　　　　嚴(yán)重的不規(guī)則。至少有25%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具有活性的胚　　　　　　　　　　胎細(xì)胞團(tuán)。 4 （Ｄ）級：死亡或退化。退化的胚胎、卵母細(xì)胞或1細(xì)胞胚胎，沒有活力。,胚胎質(zhì)量分級評定標(biāo)準(zhǔn),6.胚胎的移植,胚胎的移植也有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式，手術(shù)法一般用于所有的動(dòng)物，主要用于小動(dòng)物。而非手

16、術(shù)法僅適用于牛、馬及馬鹿等大動(dòng)物 。,五、胚胎移植存在的主要問題,（一）胚胎來源問題限制了胚胎移植的效率和實(shí)際應(yīng)用（二）我國缺乏熟練操作胚胎移植的技術(shù)人員（三）胚胎冷凍保存目前仍存在著諸多問題（四）胚胎移植費(fèi)用高，人力和時(shí)間消費(fèi)大，條件嚴(yán)格，這也制約了它的推廣應(yīng)用。（五）羊、豬胚胎采集和移植主要采用手術(shù)法，不僅易造成粘連，受體重復(fù)使用受限制，操作也不方便。,傳統(tǒng)的胚胎移植主要由以下一些步驟組成： 1. 超數(shù)排卵 2. 同

17、期發(fā)情 3. 胚胎收集和預(yù)處理 4.胚胎移植,以小鼠為例：,1.結(jié)扎公鼠的制備 為了獲得同步發(fā)情的假孕母鼠，要準(zhǔn)備結(jié)扎公鼠，通常選用5周齡公鼠做手術(shù)，分籠飼養(yǎng)，每籠一只。術(shù)后2～3周即完全康復(fù)，可用其生產(chǎn)假孕母鼠。,目的：為了產(chǎn)生同期發(fā)情的母鼠,2.超數(shù)排卵 腹腔注射PMSG 10U，一般選擇在中午注射，間隔48小時(shí)后注射HCG，光照周期保持12～14h，,將注射HCG后的母鼠與正常公鼠合籠，并于

18、第二天早上檢查陰道栓，如果見栓說明已經(jīng)配上種了，計(jì)做懷孕0天。受體母鼠(普通發(fā)情母鼠)與結(jié)扎公鼠合籠，第二天早上檢查陰道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植。,3.同期發(fā)情,計(jì)算時(shí)間,4.胚胎收集和預(yù)處理（1）受精卵的收集和處理見栓當(dāng)日的胚胎處于1細(xì)胞期。 以脫頸椎法殺死母鼠，暴露子宮、輸卵管；剪下子宮、輸卵管，并置于平皿中；在滅菌平皿中剪下輸卵管置入盛有沖卵液的集卵杯中，在體視顯微鏡下撕開壺腹部，釋放受精卵并用用新鮮的

19、培養(yǎng)液洗1–2次。,用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán),（2）2～8細(xì)胞胚胎的收集 交配后20–60小時(shí)，輸卵管中存在有2–8細(xì)胞期胚胎。此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)脫掉，可用1ml的注射器自輸卵管傘口沖得胚胎。其基本步驟如下：取輸卵管，在體視顯微鏡下找到輸卵管傘口，傘口呈平截狀，周邊略顯粗糙。然后，用鑷子輕輕夾住傘口下部位，慢慢將沖卵針插入傘口，再用鑷子輕輕夾住針頭，推壓注射器，胚胎從另一端沖出。洗滌胚胎：收集沖得的胚胎，用新鮮

20、的培養(yǎng)液洗1–2次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)過程。,,沖卵,（3）桑葚胚與囊胚的收集 交配后60–72小時(shí)，一些致密的8細(xì)胞胚胎已進(jìn)入子宮。而桑椹胚和囊胚的收集則一定要從子宮中獲得。,5.胚胎移植（1）輸卵管移植 根據(jù)胚胎數(shù)，確定供胚胎移植的受體母鼠數(shù)，并做好手術(shù)準(zhǔn)備。手術(shù)切口位于兩側(cè)腰部距背正中線1 cm處，左右各一個(gè)相互平行的切口。,小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手術(shù)剪切開小鼠的皮膚、肌肉、打開腹腔，暴露卵

21、巢、卵巢脂肪墊，并用鑷子夾住脂肪組織，把卵巢、輸卵管和一部分子宮角慢慢拉出，通過用紗布保護(hù)的切口置于紗布上。,在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸取胚胎，次序?yàn)槭炗?、空氣?、培養(yǎng)液、空氣泡2、胚胎(盡可能少帶入培養(yǎng)液)。空氣泡3、培養(yǎng)液。,（2）子宮移植 麻醉、剪毛、消毒；背部近中線處，最后肋骨水平上，縱向切開皮膚、腹壁，在白色脂肪體上方開一小口剪開腹膜，用鈍鑷子夾住脂肪體，從切口拉出，繼之卵巢、輸卵管、子宮相繼被

22、拉出，并小心地移入體視顯微鏡下。,用鈍鑷子輕輕夾往子宮上端，并用針頭其下的子宮壁上扎1小孔。注意不要觸及血管。并保證針扎入子宮內(nèi)腔。輕輕拔出針頭，沿該孔將移植管插入約0.5cm，輕輕吹吸管，使培養(yǎng)液后面的氣泡達(dá)到吸管末端。這時(shí)，所有的胚胎就已移入子宮內(nèi)。子宮、卵巢、輸卵管推回腹腔，復(fù)位、縫合。,大動(dòng)物的胚胎移植,工程之二：胚胎培養(yǎng),胚胎培養(yǎng)就是科學(xué)技術(shù)人員，在體外仿造類似于體內(nèi)條件的環(huán)境，使胚胎在體外得到與在體內(nèi)一樣的正常發(fā)育，這是胚胎

23、工程研究與應(yīng)用中非常重要的步驟。,胚胎培養(yǎng),培養(yǎng)開始之前，對實(shí)驗(yàn)室和所用的培養(yǎng)器具進(jìn)行徹底清洗、滅菌、清除可能的殘存的細(xì)胞毒性物質(zhì)。 培養(yǎng)液的組成，包括水、無機(jī)離子、有機(jī)成分、能源物質(zhì)、pH值、滲透壓等對胚胎發(fā)育均有很大影響。 現(xiàn)代培養(yǎng)液分為如Whitten氏液、Brinster液、BMOC－3和CZB液等簡單培養(yǎng)液和TCM－199、CMRL 1066、Ham氏液和DMEM液等復(fù)雜培養(yǎng)液兩類。,胚胎培養(yǎng)方法,即微滴培養(yǎng)法、輸卵管培養(yǎng)

24、法和中間受體培養(yǎng)法。 微滴培養(yǎng)法是利用塑料平皿制成50μl培養(yǎng)液小滴數(shù)個(gè)，每滴加入一定數(shù)量胚胎，在上面覆以滅菌且平衡好的液體石蠟。或先將液體石蠟倒入平皿中，用注射器吸培養(yǎng)液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后將培養(yǎng)皿放到5％CO2、95％空氣飽和濕度的37.5℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需要的時(shí)間。如果更換培養(yǎng)液，應(yīng)在實(shí)體顯微鏡下，用注射器或口控微吸管將培養(yǎng)液吸出，并加入新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 輸卵管培養(yǎng)法取發(fā)情動(dòng)物的輸卵管洗滌后，置于培

25、養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液面超過輸卵管，將同種或異種動(dòng)物的胚胎自傘口注入輸卵管，進(jìn)行培養(yǎng)。 中間受體培養(yǎng)法是指，操作后的胚胎可將受精卵或早期胚胎移入同種或異種動(dòng)物的胚胎，該方法沒有種屬特異性，但為了在培養(yǎng)后容易找到胚胎和對胚胎的保護(hù)，一般先用瓊脂包埋后再培養(yǎng)。,胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)法,即空氣干燥法和熒光染色法。 空氣干燥法是將胚胎放入1％檸檬酸鈉溶液中低滲10－20分鐘，盡量少帶液體，將胚胎吸到潔凈載片上，再用固定液固定?？諝飧稍锖螅?jīng)Giemsa染色

26、、計(jì)數(shù)。 熒光染色法可以廣泛應(yīng)用于牛、羊、倉鼠、小鼠、兔子、豬等胚胎計(jì)數(shù)，常用的染料有Hoechest 33342，復(fù)染液為用2.3％檸檬酸鈉配制的0.1％或0.01％的臺(tái)盼藍(lán)（TB）液。,embryo on Day 3 of culture,embryo on Day 5 of culture,,工程之三： 胚胎保存,胚胎的保存是指將胚胎在體內(nèi)或體外正常發(fā)育溫度下，暫時(shí)儲(chǔ)存起來而不使其失去活力；或者將其保存于低溫或超低溫情況下，使細(xì)

27、胞處于新陳代謝和分裂速度減慢或停止，即使其發(fā)育處于暫時(shí)停頓狀態(tài)，一旦恢復(fù)正常發(fā)育溫度時(shí)，又能再繼續(xù)發(fā)育。,（一）異種活體保存異種活體保存并不是任何一種動(dòng)物的胚胎都能在另一種動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)存活。實(shí)驗(yàn)證明，家兔輸卵管比較適于其他動(dòng)物早期胚胎的保存。 （二）常溫保存常溫保存是指胚胎在15～25℃溫度下于培養(yǎng)液中保存。這種溫度下胚胎能保存24h，隨時(shí)間的延長活力下降，此方法只能做短暫的保存和運(yùn)輸。,（三）低溫保存低溫保存是指0～5

28、℃的區(qū)域內(nèi)保存胚胎的一種方法。此時(shí)，胚胎卵裂暫停，代謝速度顯著減慢，但尚未停止。這種方法使細(xì)胞的某些成分特別是酶處于不穩(wěn)定狀態(tài)，保存時(shí)間較短。,（四）超低溫冷凍保存 胚胎冷凍保存是采取特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使胚胎在-196℃的條件下停止代謝，而升溫后又恢復(fù)活力的一種長期保存胚胎的技術(shù)。,常用工具：冷凍管,方法：避免形成冰晶，破壞胚胎細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)1.慢速降溫法2.快速降溫法（1）三步法（2）兩步法,保護(hù)劑：甘油，1,2-

29、丙二醇，DMSO儀器（慢速冷凍）：大型凍存儀,胚胎凍存的意義：能夠使優(yōu)秀品種品系(包括珍稀和瀕危動(dòng)物)的種質(zhì)得到長期保存下來，逐步地可以將生物界的所有生命基因長期保存起來，防止基因丟失。并且可以隨時(shí)復(fù)蘇、繁殖品系動(dòng)物，在遺傳理論指導(dǎo)下，可改良品種和培育新品種及品系。,工程之四： 胚胎分割,由于發(fā)育初期胚胎細(xì)胞具有全能性，采用合適的方法把胚胎分成兩個(gè)或多個(gè)部分，每一部分都具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力，為胚胎中單個(gè)卵裂球的全能性，培育遺傳型

30、相同的動(dòng)物做了初步探索。,（一）胚胎分割,胚胎分割：運(yùn)用顯微操作系統(tǒng)將哺乳動(dòng)物附植前胚胎分成若干個(gè)具有繼續(xù)發(fā)育潛力部分的生物技術(shù)，從而可獲得同孿生后代。,（一）發(fā)展史,（二）胚胎分割的基本程序,,,,,,分割器具的準(zhǔn)備,胚 胎 預(yù) 處 理,胚 胎 分 割,分割胚的培養(yǎng),分割胚的保存和移植,,,,,,體視顯微鏡,倒置顯微鏡,顯微操作儀,桑椹胚之前的胚胎分割,桑椹胚和囊胚的分割,,,,,,（二）胚胎切割技術(shù),1.切割器具的準(zhǔn)備

31、 胚胎分割需要的器械有體視顯微鏡，倒置顯微鏡和顯微操作儀。 在進(jìn)行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割針，固定管要求末端鈍圓，外徑與所固定胚胎直徑相近，內(nèi)徑一般為20～30μm。切割針目前有玻璃針和微刀兩種，玻璃針一般用實(shí)心玻璃拉成，微刀是用鋒利的金屬刀片與微細(xì)玻璃棒粘在一起制成。,2.胚胎預(yù)處理,為了減少切割損傷，胚胎在切割前一般用鏈霉蛋白酶進(jìn)行短時(shí)間處理，使透明帶軟化并變薄或去除透明帶。,3.胚胎分割,在

32、進(jìn)行胚胎切割時(shí)，先將發(fā)育良好的胚胎移入含有操作液滴的培養(yǎng)皿中，操作液常用杜氏磷酸緩沖液，然后在顯微鏡下用切割針或切割刀把胚胎一分為二。,4.分割胚的培養(yǎng),為提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明帶中或者用瓊脂包埋移入中間受體在體內(nèi)或直接在體外培養(yǎng)。,5.分割胚胎的保存和移植,胚胎分割后可以直接移植給受體，也可以進(jìn)行超低溫冷凍保存。 為提高冷凍胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或囊胚

33、階段，再進(jìn)行冷凍。,（三）胚胎分割技術(shù)的進(jìn)展,哺乳動(dòng)物的胚胎分割技術(shù)在近20年取得了較大進(jìn)展，主要表現(xiàn)為操作方法趨于簡化，效率提高。在牛的胚胎移植生產(chǎn)中，胚胎分割已用于提高胚胎移植的總受胎率和克服異性孿生不育。此外，胚胎分割取樣已用于胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因陽性胚胎的早期選擇。,應(yīng)用：1.與核移植相結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面可以培育出超純系動(dòng)物2.對小鼠、家兔、山羊等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎分割后，可以獲得同卵孿生后代3.對瀕臨滅絕的珍惜動(dòng)物也可以采

34、用這項(xiàng)新技術(shù)進(jìn)行搶救,胚胎分割的方法（1）顯微針分割法 該法適用于卵裂球階段的胚胎。操作時(shí)在顯微操作儀下將胚胎固定，用玻璃針在透明帶上作一切口，將卵裂球從透明帶中移出，并吹吸卵裂球使之離散，將其裝入2個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的空透明帶內(nèi)，進(jìn)行移植。該方法具有較高的同卵雙生率，但操作程序復(fù)雜。（2）顯微刀分割法 該法適用于對桑葚胚和早期囊胚進(jìn)行分割。在顯微操作儀下固定胚胎，用特制顯微刀片將胚胎均勻一分為二，分別裝入空透明帶中，進(jìn)行

35、移植。（3）酶軟化透明帶后顯微分割法 用0.5%的鏈霉蛋白酶軟化胚胎透明帶, 若是緊密化胚胎(如桑椹胚) , 則需在無鈣、鎂的平衡鹽溶液中處理20 分鐘, 使胚胎去緊密化，將胚胎固定，把將針置于欲分割的胚胎上面, 使其與胚胎呈30 度角, 對準(zhǔn)胚胎的正中平分線徐徐下壓，即可將一個(gè)胚胎分割成兩半。（4）酶消化去透明帶后分割法 用0.25%～0.5%的鏈霉蛋白酶去掉胚胎透明帶, 然后用顯微玻璃針或微手術(shù)刀將裸胚一分為二。

36、（5）徒手分割法 徒手分割法主要適用于分割體積較大的胚胎，其優(yōu)勢在于可以不用顯微操作儀。在立體顯微鏡下，用止血鉗夾住切割刀片，將透明帶切開一部分，再用直徑略小于胚胎的毛細(xì)管吹吸幾次，胚胎從透明帶中脫出。手持玻璃針自上而下對稱切割裸胚。這種方法多用于分割桑椹胚和囊胚。該方法操作簡便、快速，便于生產(chǎn)應(yīng)用，但要求要有較為靈巧的操作技能。,方法： 1. 用玻璃管拉成細(xì)絲，再制成切割刀，在顯微操作儀的機(jī)械手上施行分割或分散胚胎

37、。 2. 如條件較差，可徒手制成玻璃細(xì)絲，成為切割刀，在解剖鏡下徒手切割。,顯微操作儀切割,徒手切割,四.胚胎分割目前存在的問題,1.初生重低 2.遺傳一致性不同3.同卵多胎的局限性,歸納小結(jié),工程之五： 體外受精,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行體外受精，一般都著眼與基礎(chǔ)理論研究性質(zhì)，如為受精生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和繁殖學(xué)的基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｓ捎诼炎雍途拥氖芫^程是在實(shí)驗(yàn)室中完成，故通過這一技術(shù)而產(chǎn)下的動(dòng)物又稱為“試管動(dòng)物”，如“試

38、管鼠”、“試管豬”、“試管嬰兒”等。,,,,,體外受精技術(shù)的發(fā)展簡史,1、 發(fā)展簡史,1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞學(xué)者Austin分別發(fā)現(xiàn)了精子獲能（cap acitation）現(xiàn)象，使動(dòng)物體外受精研究進(jìn)入了新紀(jì)元。 1959年張明覺在世界上首先獲得了體外受精的的哺乳動(dòng)物—試管兔，推動(dòng)了體外受精研究工作的開展。 1978年首例人類試管嬰兒路易斯·布朗（Louise Brown）誕生。,直到20世紀(jì)80年

39、代，動(dòng)物的體外受精技術(shù)才取得突破，尤其是牛的體外受精技術(shù)發(fā)展迅速。 1981年Brackett等用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞獲得試管牛犢，隨后Hanada等（1985）獲得綿羊和山羊體外受精后代，并于1986年獲得體外成熟卵母細(xì)胞體外受精的第一頭犢牛。 我國學(xué)者盧克煥（1987）在愛爾蘭獲得全體外過程的試管牛犢。,（1）研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)理。 （2）在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚

40、胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價(jià)值。 （3）在人類，IVF技術(shù)是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一。 （4）體外受精技術(shù)還是哺乳動(dòng)物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分。,2、體外受精的意義,試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)嬰兒(Steptoe和Edw

41、ards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）,3、技術(shù)程序,體外受精包括以下步驟：卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)、精子獲能、卵母細(xì)胞受精和受精后的體外胚胎培養(yǎng)。,(一).卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng),對不同動(dòng)物,采集卵母細(xì)胞的方法不同。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等卵細(xì)胞的采集： 最常用

42、的方法是卵巢經(jīng)過 處理，具體做法是給供體注射 ，使一頭母畜一次排出比自然情況下多幾倍到十幾倍的卵子，之后從 中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。,超數(shù)排卵,促性腺激素,輸卵管,大家畜或大型動(dòng)物，如牛，卵細(xì)胞的采集： 從屠宰場已屠宰母畜的 中采集卵母細(xì)胞，也可以借助 、 或 等工具確定卵泡位置，直接從活體動(dòng)物中吸取泡卵液（連同

43、卵母細(xì)胞）取出，在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)，使其成熟。,卵巢,超聲波(B超)探測儀,內(nèi)窺鏡,腹腔鏡,卵母細(xì)胞一般檢測,得到卵母細(xì)胞后，可根據(jù)卵泡發(fā)育的不同時(shí)期，在顯微鏡下檢查核和胞質(zhì)發(fā)育的狀況，如核的形態(tài)、位置和所處的時(shí)期。 排出的卵母細(xì)胞，有多層卵丘細(xì)胞包圍，除去卵丘細(xì)胞后，可以見到卵周隙增大，內(nèi)有第一極體，核處于第二次成熟分裂中期。 多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈透明狀，但由于胞質(zhì)中富含大量脂滴和空泡，所以在鏡下呈暗色。 各種不同的動(dòng)物

44、，按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，卵的分類可以分為優(yōu)秀、普通、不良和異常卵。 進(jìn)行體外受精的卵母細(xì)胞，一般以卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體外面完整地包有3－4層卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)無斑塊者為佳。,鏡檢卵母細(xì)胞,如果新鮮或固定后要作整體觀察，可以取凡士林石蠟（1：1）融化后滴于載片中部四角，在鏡下用微吸管自平皿中吸取卵母細(xì)胞，滴到4滴凡士林石蠟滴的中央，蓋上蓋片并輕壓之，即可置于相差顯微鏡下觀察。 如果要觀察細(xì)節(jié)，需要染色、切片后觀察。一般在卵固定后水洗染

45、色，用瓊脂與石蠟進(jìn)行雙重包埋，最后進(jìn)行切片、脫臘和封固，進(jìn)行觀察。,（二）卵母細(xì)胞的篩選,只有周圍包被著完整卵丘（A級）或部分卵丘脫落（B級）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細(xì)胞才能進(jìn)行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。,（三）卵母細(xì)胞的體外成熟方法,1.成熟培養(yǎng)液的選擇 基礎(chǔ)培養(yǎng)液TCM199中的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤等對卵母細(xì)胞核成熟有抑制作用的成分濃度較低，培養(yǎng)的效果相對較好。 體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞還要在基礎(chǔ)液

46、加入一定濃度的血清（5％－10％的FCS或ECS）和促性腺素（0.1－1.0µg/ml FSH和5－10µg /ml LH等）等成分。 2.成熟培養(yǎng)的時(shí)間 對大多數(shù)家畜來講，卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)時(shí)間一般采用22－24h，但是也要依據(jù)動(dòng)物而定。,3.成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境 溫度：目前，除人和嚙齒類動(dòng)物的卵母細(xì)胞體外成熟仍采用37℃外，牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細(xì)

47、胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38－39℃。 氣象環(huán)境： CO2的濃度：應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽來定。由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為25－30mmol/L，故一般都采用5％的CO2。 4.成熟培養(yǎng)的系統(tǒng) 大致可分為三大類。 ①開放培養(yǎng)系統(tǒng)： 將1－2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平面皿內(nèi)或五孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后放入50－200枚卵母

48、細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，上面不覆蓋石蠟油。,②微滴培養(yǎng)系統(tǒng)： 將成熟培養(yǎng)液先在組織培養(yǎng)皿中做成50－500µl的微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細(xì)胞置于其中培養(yǎng)。 在一般情況下，這種培養(yǎng)液用在卵母細(xì)胞數(shù)量特別少的情況下采用。 ③密閉培養(yǎng)系統(tǒng)： 將卵母細(xì)胞置于含有1－2ml成熟培養(yǎng)液的試管中，加蓋膠塞，然后在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；如若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入一

49、個(gè)密閉的塑料袋內(nèi)。,(四)體外受精,1.精子的獲取 精子來源比較方便，大、中型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般通過人工按摩采精或假陰道采精，都能獲得成熟的精子，小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都是通過手術(shù)，從駐精囊和輸精管內(nèi)取得成熟的精子。,2.精子的分離與制備是體外受精技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),精液中的精子獲能抑制因子冷凍精液中的防凍劑和蛋黃等成分 影響和干擾受精的完成過多的留在受精液中的死精子,① 懸浮法（swim up）：

50、 是篩選高活力精子最為有效的一種方法。 ② 玻璃棉（glasswool）過濾法： 該法可有效地濾除品質(zhì)較差精液中的死精子，大提高精子的受精穿透率。,方法：,精子的獲能：剛射出的精子不能穿入卵子，只有在雌性生殖道內(nèi)度過一段時(shí)間之后，才獲得受精能力的現(xiàn)象。,③ BAS/哌可（Percoll）密度梯度離心法： 采用不連續(xù)的BSA密度梯度可以分離得到形態(tài)

51、正常的高活力精子。 ④ 離心洗滌法： 對于精子活力較好的精液可采用直接離心洗滌法制備用于體外受精的精子。,3.精子獲能原理,目前精子的獲能處理方法主要有：,① 與血清白蛋白的溶液長時(shí)間孵育： 原理是血清中白蛋白具有很強(qiáng)結(jié)合膽固醇和鋅離子的能力，可除去質(zhì)膜中部分膽固醇和鋅離子，改變精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子獲能。 ② 用高離子強(qiáng)度溶液處理精子： 精子表面的去能

52、因子（被膜蛋白），當(dāng)用高離子強(qiáng)度溶液處理精子時(shí)，將從精子的表面脫落，從而導(dǎo)致精子獲能。 ③ 與含有卵泡液的培養(yǎng)液進(jìn)行孵育： 在培養(yǎng)液中添加一定濃度的卵泡液將有可能誘發(fā)精子獲能。,④ 使用鈣離子載體A23187： 直接誘發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而導(dǎo)致精子獲能。 ⑤ 使用肝素： 是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，當(dāng)它與精子結(jié)合后，能引起Ca2+進(jìn)入精

53、子細(xì)胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子的獲能。是一種接近于體內(nèi)獲能的生理性方法，已經(jīng)成為動(dòng)物體外受精應(yīng)用最廣的一種精子獲能方法。,精子入卵的三道屏障： 擴(kuò)展的卵丘 透明帶 卵質(zhì)膜,,弱精、畸精、少精癥患者的精子很難穿越三道屏障,人為使得精子獲能,可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道獲能沒有種屬特異性，因而可以由屠宰場取任何的動(dòng)物的子宮或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取小動(dòng)物的子宮給所需動(dòng)物的精子獲能。 另外，可以利用人工配制

54、的培養(yǎng)液使得精子獲能。,（3）.受精,獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵子，一般情況下在 或中完成受精過程。,獲能溶液,專用受精溶液,,,（4）、胚胎的早期培養(yǎng),概念：是應(yīng)用人工創(chuàng)造條件，對獲取的 進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)液成分：水、無機(jī)鹽、糖類、維生素、氨基酸、激素、核苷酸、血清等,早期胚胎,,不同動(dòng)物胚胎移植時(shí)間不同牛、羊：桑椹胚或囊胚階段小鼠、家兔：卵裂期或囊胚階段試管嬰兒

55、：8個(gè)或16個(gè)細(xì)胞階段,胚胎培養(yǎng)發(fā)育到適宜階段時(shí)，可將其取出向受體移植或冷凍保存。,20世紀(jì)80年代又發(fā)展起來了單精顯微注射技術(shù)，它是借助顯微操作儀，將精子或精子細(xì)胞 直接注入卵母細(xì)胞質(zhì)中（胞質(zhì)內(nèi)受精I(xiàn)CSI）或卵周隙中（帶下受精SUZI）來實(shí)現(xiàn)受精的過程。由于該技術(shù)可排除透明帶甚至質(zhì)膜對精子入卵的阻礙作用，故對精子的死活及其完整性無嚴(yán)格要求，因此，該技術(shù)對動(dòng)物受精機(jī)理研究、男性不育的治療以及野生動(dòng)物保護(hù)等方面具有重大意義。

56、第一代試管嬰兒 第二代試管嬰兒 第三代試管嬰兒,工程之六: 顯微注射,一、顯微受精又稱卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI） ，是指用顯微操作儀將單個(gè)完整精子或精核注人卵周隙或卵胞質(zhì)中，激活卵母細(xì)胞并完成受精作用。其特點(diǎn)是顯微受精過程不受精子的數(shù)量、活力及形態(tài)等因素的影響而單精迅速完成受精過程。,常見于大型醫(yī)院的不孕不育癥專科,二、原核注射(用于制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物),囊胚顯微注射(用于基因敲除動(dòng)物的制作）,顯微受精技

57、術(shù)在動(dòng)物受精和發(fā)育機(jī)理研究、畜牧業(yè)生產(chǎn)及人醫(yī)臨床實(shí)踐中有著廣闊的應(yīng)用前景：精液的利用率可成百萬倍的提高，可以使優(yōu)良種公畜得到最充分的應(yīng)用；精子的保存技術(shù)將大為簡化，將來或許只要精子核物質(zhì)完整就可以達(dá)到受精的目的，這對世界珍稀動(dòng)物資源的保護(hù)將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響；與其他技術(shù)結(jié)合，如將已經(jīng)過性別鑒定的精子注入卵子受精，可人為控制家畜后代的性別。,工程之七： 卵的激活與孤雌發(fā)育,在昆蟲中，卵不經(jīng)過受精就能發(fā)育成新個(gè)體的現(xiàn)象稱為孤雌生殖。如：較

58、熟悉的家蠶，就能進(jìn)行偶發(fā)性的孤雌生殖 。蜜蜂可以經(jīng)常性的孤雌生殖，雌蜂在排卵的時(shí)候并非所有的卵都是受精的。在這種情況下，受精卵發(fā)育成雌蜂，非受精卵發(fā)育成雄蜂 。蚜蟲可以進(jìn)行周期性的孤雌生殖許多蚜蟲只在冬季將要來臨的時(shí)候才產(chǎn)生雄蚜，進(jìn)行雌雄交配，產(chǎn)受精卵越冬；而從春季到秋季連續(xù)十余代都以孤雌生殖繁殖后代。,哺乳動(dòng)物卵子完成第1次成熟分裂以后，進(jìn)人第2次成熟分裂的中期即休止期待到精子穿入卵子后，才繼續(xù)發(fā)育，完成第2次成熟分裂這個(gè)重要過程，這

59、時(shí)出現(xiàn)第2極體。因此，第2極體的出現(xiàn)是判斷精卵在一起是否完成受精過程的標(biāo)志。,使用物理(電)與化學(xué)(乙醇)刺激(人工激活)，象精子一樣可引起卵子激話，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)變化，啟動(dòng)第2次成熟分裂排出第2極體，原核形成和卵裂等一系列變化。,工程之八： 細(xì)胞核移植與克隆技術(shù),核移植技術(shù)起源于用微細(xì)玻璃管對阿米巴原蟲進(jìn)行的核注射，核移植技術(shù)的發(fā)展史幾乎就是克隆技術(shù)的發(fā)展史。最早建立的克隆技術(shù)史兩棲類的克隆技術(shù)。1952年，Briggs和K